Chúng tôi đã thiết kế được một bộ mồi gồm 4 cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu đoạn gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam. Trình tự các mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại được trình bày chi tiết trong Bảng 8.
Bảng 8: Mồi khuếch đại gen penton của HAdV-3 ở Việt Nam Tên
mồi Trình tự (chiều 5’-3’)
Kích thước sản phẩm khuếch đại
(bp)
PF1 TAACAAACTGCTGGACTACC
4238
PR1 CCCTAATCGTCTGCTGATAG
PF2 GTGTTGGACTTGGGTGGAAG
2982
PR2 CCAGTACGTCTTCTAGCCTC
PF3 GTGCTGGAAAGTGACATTGG
1420
PR3 CTAAGCATGGCTCTTCGCC
PF4 TGCCCGTCTTCTCAAAGAGT
565
PR4 CACAGTAGATGTAGGCGCAG
3.2.2. Kết quả khuếch đại PCR gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 13 cho thấy các băng sản phẩm PCR của tất cả các cặp mồi đều sáng bằng hoặc sáng hơn marker tương ứng, điều này chứng tỏ số bản sao sản phẩm khuếch đại đã đạt đến lượng tiêu chuẩn. Vị trí của các băng cũng cho thấy kích thước các sản phẩm này đều phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Bên cạnh đó, các giếng đkhông có vệt smear hoặc sản phẩm phụ nào, chứng tỏ sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu và đáng tin cậy. Như vậy, các sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR mà chúng tôi thực hiện, đều đủ điều kiện để được tinh sạch trực tiếp, không cần phải thực
31
hiện thôi gel để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn. Sản phẩm sau tinh sạch đã được gửi cho công ty 1stBASE để giải trình tự.
Hình 13: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen penton 3.2.3. Kết quả giải trình tự gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 14, các đỉnh tín hiệu giải trình tự đều rất rõ ràng và đạt độ phân giải cao.
Tín hiệu nhiễu nền rất thấp hoặc không có. Tổng độ dài trình tự chúng tôi đã giải được từ 4 cặp mồi PF1-PR1, PF2-PR2, PF3-PR3, và PF4-PR4 sử dụng trong nghiên cứu này là 4126 bp. Tuy nhiên, sau khi lược bỏ những trình tự không thuộc vùng mã hóa thì chiều dài gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam thu được là 1635 bp. Như vậy, độ dài chuỗi axit amin của các protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam là 545 axit amin. Kích thước này cũng tương tự so với trình tự đã công bố của HAdV-3 tham chiếu trên cơ sở dữ liệu NCBI. Chứng tỏ, chúng tôi đã giải thành công trình tự của gen penton của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam với độ tin cậy cao.
Hình 14: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
32
3.2.4. Kết quả so sánh trình tự mã hóa gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam
Sau khi thu được trình tự ADN hoàn chỉnh của cả gen penton. Chúng tôi đã so sánh nó với trình tự genome tham khảo của HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI, mã trình tự là NC_011203.1. Thông qua việc so sánh này, chúng tôi đã phát hiện được những biến đổi ở cả cấp độ ADN và axit amin của gen và protein penton. Các kết quả so sánh được biểu diễn trên phần mềm Bioedit (Hình 15), và được tổng hợp lại trong các Bảng 9.
Hình 15: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen penton
33
Bảng 9: Các biến đổi trên gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu
STT Vị trí Nucleotide Axit amin
biến đổi NC_011203.1 HAdV-3 Việt Nam
1 13998 A C I32L
2 14033 A G -
3 14141 C T -
4 14360 A G -
5 14377 C T T158I
6 14414 G A -
7 14437 T C I178T
8 14456 T C -
9 14471 G C -
10 14474 C T -
11 14525 G A -
12 14573 T C -
13 14576 C T -
14 14618 T A -
15 14654 A T -
16 14720 G A -
17 14750 C T -
18 14880 G A D326N
19 14900 C T -
20 15026 A G -
21 15038 T C -
22 15068 T C -
23 15098 C T -
24 15288 G A A462T
34
Như vậy, phần mã hóa của gen penton có tổng cộng là 24 các biến đổi ADN trên tổng chiều dài là 1635 bp. Trong đó có 5 biến đổi ADN dẫn đến thay thế axit amin. Từ đó, chúng tôi đã tính ra tỉ lệ biến đổi ở mức độ ADN của gen penton là 1,47%. Tương tự với cách tính như vậy, tỉ lệ số lượng axit amin bị thay thế trên tổng số biến đổi nucleotide của gen penton là 20,83%. Cuối cùng, tỉ lệ biến đổi axit amin trên tổng số axit amin của protein penton là 0,92%.
Để có cái nhìn rõ ràng hơn về vị trí của các biến đổi axit amin trên cấu trúc không gian của protein penton, và đánh giá được chi tiết hơn về những tác động của các biến đổi này có thể mang lại, chúng tôi thực hiện bước tiếp theo là xây dựng cấu trúc 3D mô phỏng của protein này.
3.2.5. Kết quả phân tích cấu trúc ba chiều protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam Sử dụng chương trình SWISS-MODEL kết hợp với dữ liệu của ngân hàng dữ liệu protein, chúng tôi đã mô phỏng thành công cấu trúc 3D của protein penton của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. Các biến đổi axit amin được thể hiện dưới dạng tinh thể trong phần mềm pyMOL. Có một biến đổi không được thể hiện lên hình là do phần mềm không xây dựng được phần cấu trúc mang biến đổi, đó là đầu N của protein penton.
Cấu trúc dự đoán của penton HAdV-3 Việt Nam được xây dựng dựa trên cấu trúc khuôn 4aqq.1.A [56], có độ tương đồng trình tự axit amin là 98,62%. Trên phần mềm pyMOL, chúng tôi thể hiện được vị trí của 4 trong 5 biến đổi axit amin (ngoại trừ I32L nằm ở đầu N, vì chương trình SWISS-MODEL chỉ dự đoán được cấu trúc của axit amin thứ 48 đến 542) (Hình 16C).
35
Hình 16: Protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam và các axit amin biến đổi A. So sánh trình tự axit amin protein penton, B. Nhìn từ bên ngoài, C. Nhìn ngang
Hình ảnh biểu diễn cho thấy các biến đổi T158I, D326N và A462T nằm ở vị trí mặt trên protein penton, những biến đổi này có thể đã ảnh hưởng đến khả năng tương tác giữa penton và fiber. Trong đó, T158I có sự thay đổi lớn nhất về tính ưa nước do I có chỉ số H là 4,5 cao hơn rất nhiều so với -0,7 của T, làm cho vị trí 158 từ trung tính trở nên kỵ nước rất mạnh (Bảng 10). Tiếp theo, D326N đã tạo ra một sự thay đổi lớn về tính axit, vì D là 1 axit amin có tính axit mạnh bị chuyển thành N là 1 axit amin trung tính. Biến đổi A462T lại không thể hiện sự thay đổi rõ rệt nào về các tính chất, chỉ chuyển từ kỵ nước nhẹ (A) sang trung tính (T). Tuy nhiên, A462T là vị trí thuộc 1 chuỗi xoắn α nằm ở vị trí trung tâm của pentamer penton, vì vậy mà nó có nguy cơ làm thay đổi một phần cấu trúc penton, từ đó dẫn đến thay đổi khả năng liên kết giữa các monomer với nhau để tạo thành cấu trúc pentamer.
A
36
Bảng 10: Các biến đổi axit amin trên protein penton Vị trí
biến đổi
Axit amin ban đầu
Giá trị pI
Chỉ số H
Axit amin thay thế
Giá trị pI
Chỉ số H I32L I (Isoleucine) 6,04 4,5 L (Leucine) 6,04 3,8 T158I T (Threonine) 5,60 -0,7 I (Isoleucine) 6,04 4,5 I178T I (Isoleucine) 6,04 4,5 T (Threonine) 5,60 -0,7 D326N D (Aspartate) 2,87 -3,5 N (Asparagine) 5,41 -3,5 A462T A (Alanine) 6,11 1,8 T (Threonine) 5,60 -0,7 Ngoài ra, biến đổi I178T nằm ở mặt bên của penton, là vị trí tiếp xúc với hexon, tạo nên cấu trúc “nhóm sáu” (Group of Six – GOS) có chức năng liên kết các
“nhóm chín” (Group of Nine – GON) với nhau [9, 30]. Biến đổi này có thể ảnh hướng rất lớn đến khả năng gắn của penton với hexon vì I là axit amin có tính kị nước lớn nhất bị thay thế bởi T trung tính (Bảng 10). Cuối cùng, biến đổi I32L là vị trí xảy ra nhiều tương tác và giữ chức năng quan trọng trong việc cuộn gập penton. Vị trí I32L thuộc đầu N, tương tác với cả hexon và protein IIIa; trong khi đó, các tương tác tại đầu N của penton được chỉ ra là rất quan trọng để giữ vững được cấu trúc vỏ capsid của HAdV [30, 71]. Là vị trí đứng trước P48, nên I32L cũng có thể gián tiếp hỗ trợ cho penton cuộn gập chính xác, hình thành nên cấu trúc Dodecahedron [56].
Như vậy, cả 5 biến đổi nhầm nghĩa trên gen penton đều dẫn đến những biến đổi axit amin nằm ở những vùng tương tác quan trọng giữa penton với fiber, hexon và protein IIIa. Dựa trên những thuộc tính của các axit amin bị biến đổi, chúng tôi dự đoán hậu quả có thể đã giúp HAdV-3 tăng khả năng sống sót và xâm nhiễm vào tế bào. Đặc biệt là biến đổi I32L nằm ở đầu N của penton có thể đã làm tăng số lượng cấu trúc Dodecahedron giúp virus tăng độc lực.
37