Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
Trong thực tế sản xuất, vacxin phòng bệnh do PPV (bệnh khô thai) chỉ được dùng cho lợn hậu bị và lợn nái. Do vậy, để nghiên cứu sự lưu hành huyết thanh học PPV, nghiên cứu này tập trung vào nhóm lợn thịt trong giai đoạn 40 đến 80 ngày tuổi (đối tượng không được tiêm vacxin PPV). Mẫu được lấy ở các hộ chăn nuôi với quy mô > 100 và ≤ 100 lợn thịt.
Ngoài ra, để nghiên cứu sự lưu hành kháng thể thụ động kháng PPV, chúng tôi tiến hành khảo sát ở 1 trang trại có tiêm vacxin PPV cho lợn nái. Các đối tượng lấy mẫu bao gồm: lợn nái (đẻ lứa 2), lợn con theo mẹ (tương ứng với mỗi lợn nái) và lợn sau cai sữa.
Do mẫu huyết thanh được thu thập từ 2 nhóm lợn khác nhau (nhóm tiêm vacxin (lợn nái) và nhóm không tiêm vacxin (lợn thịt), nênchúng tôi đã tách rời 2 nhóm này trong các phân tích về lưu hành huyết thanh học.
3.5.2. Phương pháp lấy mẫu máu lợn
Mẫu máu được lấy ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn (2- 3ml/cá thể), sau đó được để đông tự nhiên trong syringe. Chắt huyết thanh bằng cách ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút ở nhiệt độ phòng.Mẫu huyết thanh bảo quản ở - 20oC cho đến khi xét nghiệm.
3.5.3. Phương pháp chế hồng cầu chuột lang 0,5%
Lấy máu của chuột lang khỏe mạnh, cân nặng khoảng 200 gam. Hình 3.1 minh họa thao tác lấy máu vịnh tĩnh mạnh cổ chuột lang.
Hình 3.1. Phương pháp lấy máu vịnh tĩnh mạch cổ của chuột lang
Cố định chuột lang nằm ngửa, cắt sạch lông vùng cửa vào lồng ngực, sát trùng vùng lấy máu bằng cồn 70%. Hút sẵn vào bơm tiêm một lượng dung dịch citrate natri 3% trước khi lấy máu. Máu lấy được cho vào ống ly tâm 15 ml đã chuẩn bị sẵn, lắc nhẹ. Rửa hồng cầu bằng cách ly tâm với tốc độ 1000 vòng/ phút trong 5 phút. Dùng pipette loại bỏ phần nước trong ở bên trên. Lặp lại bước rửa hồng cầu từ 3-4 lần để thu được hồng cầu sạch dùng cho phản ứng ngưng kết và ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Pha dung dịch hồng cầu 0,5% bằng nước sinh lý.
3.5.4. Phương pháp thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) 3.5.4.1 Nguyên liệu
- Hồng cầu chuột lang 0,5%;
- Kháng nguyên chuẩn Porcine Parvovirus (PPV);
- Nước sinh lý 0,9%.
3.5.4.2. Tiến hành phản ứng
- Phản ứng được tiến hành trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V
- Dựng micropipette nhỏ đều vào tất cả cỏc giếng, mỗi giếng 50 àl nước muối sinh lý 0,9%.
- Cho tiếp vào giếng đầu tiờn của mỗi hàng 50 àl PPV, trộn đều sau đú hỳt 50 àl từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai, trộn đều và hỳt 50 àl từ giếng thứ 2 sang giếng thứ 3, cứ làm như vậy cho đến giếng cuối cùng. Đến giếng cuối cùng thỡ hỳt bỏ đi 50 àl.
- Như vậy trong mỗi giếng đều chứa một lượng 50 àl nhưng cú độ pha loãng gấp đôi ở giếng tiếp theo. Ban đầu PPV có độ pha loãng là 1:2. Sau khi đã xử lý độ pha loãng của PPV ở các giếng là: 1/4, 1/8, ..., 1/4096.
- Dựng micropipette nhỏ đều vào mỗi giếng 50 àl dung dịch hồng cầu 0,5%, lắc nhẹ cho hồng cầu phân bố đều trong các giếng. Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 0,5 giờ đọc kết quả.
- Bố trớ đối chứng hồng cầu: nhỏ vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 50 àl dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và 50 àl dung dịch hồng cầu 0,5%.
3.5.4.3 Đọc kết quả phản ứng
- Phản ứng dương tính: hồng cầu bị ngưng kết thành mảng mỏng đều dưới đáy giếng, hoặc hồng cầu tản mạn xung quanh thành hình mạng lưới hay hình sao. Khi nghiêng đĩa không thấy hồng cầu chảy thành dòng.
- Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ giống giếng đối chứng hồng cầu, khi nghiêng đĩa thấy hồng cầu chảy thành dòng.
- Hiệu giá phản ứng HA: là độ pha loãng virus cao nhất mà ở đó vẫn còn virus gây ngưng kết hồng cầu, người ta gọi đó là một đơn vị HA (HAU).
3.5.5. Phương pháp chuẩn độ ngược
Trong mỗi lần thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, lượng virus cần đảm bảo chính xác. Vì vậy, cần tiến hành chuẩn độ ngược để xác định chính xác việc pha 4 đơn vị HA là chính xác. Các bước thực hiện như sau:
- Trên đĩa nhựa 96 giếng đáy hình chữa V, dùng 4 dãy, mỗi dãy 4 giếng;
- Nhỏ vào mỗi giếng 50 àl nước sinh lý;
- Ở giếng đầu của mỗi dóy, nhỏ 50 àl khỏng nguyờn đó pha 4 HAU;
- Trộn đều, hỳt đều 50 àl chuyển từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai, làm như vậy đến giếng thứ 3, thỡ hỳt bỏ đi 50 àl;
- Thể tớch dung dịch trong mỗi giếng khi này là 50 àl. Hiệu giỏ HA của cỏc giếng lần lượt là 2 HAU, 1 HAU và 1/2 HAU;
- Sau đú nhỏ 50 àl hồng cầu vào tất cả cỏc giếng, giếng thứ 4 làm đối chứng chỉ có nước sinh lý và hồng cầu ;
- Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi đọc kết quả. Nếu ngưng kết hoàn toàn xảy ra đến giếng thứ hai, thì kháng nguyên pha đúng 4 HAU.
3.5.6. Phương pháp xử lý huyết thanh xét nghiệm
Để loại bỏ yếu tố gây ngưng kết, trước khi thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, toàn bộ mẫu huyết thanh trước xử lý bằng cách cho hấp phụ hồng cầu 10%. Các bước được tóm tắt như sau:
- Chuyển 0,1 ml huyết thanh xét nghiệm vào ống Eppendorf, chuyển 0,1 ml hồng cầu 10% (tỷ lệ 1:1), lắc nhẹ;
- Đậy nắp và để ngang ống cho diện tích tiếp xúc là lớn nhất;
- Huyết thanh được giữ ở 4oC/12 giờ;
- Ly tâm 1000 vòng/ phút/5 phút, thu huyết thanh;
- Các mẫu huyết thanh sau khi đã được xử lý như trên không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu hoặc ức chế phản ứng HA được bảo quản ở -20oC.
3.5.7. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng HI được dùng để xác định sự có mặt của kháng thể kháng PPV có trong huyết thanh của lợn.
3.5.7.1. Nguyên liệu
- Hồng cầu chuột lang 0,5%.
- Kháng nguyên Porcine Parvovirus (PPV): pha ở nồng độ 4 HAU.
- Nước muối sinh lý 0,9%.
- Huyết thanh lợn cần xét nghiệm đã hấp phụ hồng cầu.
3.5.7.2. Tiến hành phản ứng
- Phản ứng được tiến hành trên đĩa 96 giếng đáy chữ V.
- Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2:
+) Dựng pipette cho đều vào mỗi giếng 25 àl nước muối sinh lý 0,9%.
+) Mỗi mẫu huyết thanh lấy 25 àl cho vào giếng đầu tiờn mỗi hàng. Sau đú dựng micropipet trộn đều và hỳt 25 àl từ giếng đầu tiờn chuyển sang giếng thứ hai, trộn đều, hỳt 25 àl chuyển sang giếng thứ 3. Cứ làm như vậy đến giếng cuối cựng hỳt 25 àl dung dịch bỏ đi.
+) Dãy huyết thanh có độ pha loãng là: 1/4, 1/8, .... , 1/4096.
- Thực hiện phản ứng trung hòa:
+) Dựng micropipette nhỏ đều vào mỗi giếng 25 àl dung dịch PPV đó pha thành 4 đơn vị HA, lắc nhẹ khay nhựa và đậy khay để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng nguyên và kháng thể tác động với nhau. Sau đó cho đều vào tất cả các giếng trờn đĩa, mỗi giếng 50 àl dung dịch hồng cầu 0,5%.
- Đối chứng hồng cầu: cho vào mỗi giếng 50 àl dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và 50 àl dung dịch hồng cầu 0,5%.
- Đối chứng virus: chuẩn độ ngược 4 đơn vị HA.
- Đối chứng ngưng kết không đặc hiệu của huyết thanh: cho vào mỗi giếng 25 àl dung dịch nước muối sinh lý 0,9%, 25 àl dung dịch huyết thanh và 50 àl dung dịch hồng cầu 0,5%. Nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, chứng tỏ có mặt của yếu tố ngưng kết không đặc hiệu.Mẫu huyết thanh khi này phải tiếp tục xử lý để loại bỏ yếu tố không đặc hiệu.
3.5.7.3. Đọc kết quả
- Sự hợp lệ của kết quả phản ứng: (i) đối chứng hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết, (ii) hiện tượng ngưng kết chỉ đến giếng thứ 2, (iii) đối chứng huyết thanh & hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết.
- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng thành cục tròn đỏ dưới đáy giếng giống đối chứng hồng cầu. Điều đó có nghĩa là trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu kháng PPV, kháng thể đã kết hợp với virus tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Do đó virus đã kết hợp với kháng thể nên không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu, hồng cầu lắng thành cục tròn đỏ dưới đáy giếng. Hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở virus gây ngưng kết hồng cầu.
- Phản ứng âm tính: xảy ra hiện tương ngưng kết hồng cầu. Điều đó xảy ra khi trong huyết thanh không chứa kháng thể đặc hiệu với PPV, nên PPV không bị kết hợp để tạo phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Kết quả là PPV tự do đã gây ngưng kết hồng cầu.
3.5.8. Phương pháp tách chiết ADN
Tinh sạch ADN tổng số được thực hiện theo các bước như sau:
(i) Ly giải mẫu
- 250 àl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 àl dung dịch sucrose/proteinase K;
- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ.
(ii) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1) - Bổ sung 200 àl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải;
- Vortex hỗn hợp;
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
(iii) Tủa ADN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450μl isopropyl + 450μl dịch nổi phía trên, trộn đều;
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút;
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
(iv) Rửa tủa ADN
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC);
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC;
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
(v) Hòa tan tủa ADN
- Tủa ADN được hũa tan trong 30àl dung dịch đệm TE (pH = 8,0).
3.5.9. Phương pháp PCR phát hiện PPV
Cặp mồi đặc hiệu dùng phát hiện PPV được lựa chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố (Xu, 2012), trình tự được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện PPV Tên mồi xuôi/
ngược Trình tự 5’ – 3’ Vị trí
gen NS1
Kích thước (bp)
PPVF/ AGTTAGAATAGGATGCGAGGAA 1761–1782
/PPVR AGAGTCTGTTGGTGTATTTATTGG 2026–2002 265
Bảng 3.2 trình bày chu trình nhiệt của phản ứng PCR phát hiện PPV.
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Giai đoạn
phản ứng
Nhiệt độ (oC)
Thời gian (giây)
Số vòng lặp
Tiền biến tính 94 180 1
Biến tính 94 15
40
Bắt mồi 57,1 20
Kéo dài 72 30
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafeNucleic Acid Staining Solution 1x.
3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Mối quan hệ di truyền của PPV (phylogenetic tree) được xây dựng dựa trên một phần trình tự gen mã hóa protein NS1. Phần mềm MEGA6 (Tamura, 2013) được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại với các tham số đầu vào như sau: (i) phương pháp suy diễn cây phát sinh chủng loại là Neighbor- Joining; (ii) mô phỏng sự thay đổi nucleotide giữa các trình tự gen dựa vào mô hình Tajima-Nei và có hiệu chỉnh sự biến động giữa các nucleotide; (iii) mức tin cậy ở các nhánh của cây phát sinh chủng loại được ước tính bằng phép thử bootstrap lặp lại 1000 lần. Các trình tự tham chiếu (để xác định nhóm di truyền) dựa theo công bố trước đây.
Bảng 3.3. Trình tự gen NS1 dùng trong nghiên cứu
TT Mã số Tên chủng Nước TT Tên chủng Nước
1 NADL-2 NC001718 Mỹ 16 P1 Việt Nam
2 Kresse U44978 Mỹ 17 P2 Việt Nam
3 Tornau AY684869 Đức 18 P3 Việt Nam
4 IDT AY684872 Đức 19 P4 Việt Nam
5 POVG D00623 Tây Ban Nha 20 P5 Việt Nam
6 POVNADL-2 M38367 Mỹ 22 P6 Việt Nam
7 VRI-1 AY390557 Hàn Quốc 23 P7 Việt Nam
8 SR1 DQ675456 Trung Quốc 24 P8 Việt Nam
9 Unnamed AY502114 Trung Quốc 25 P9 Việt Nam
10 Nanjin-1 AY739664 Trung Quốc 26 P11 Việt Nam
11 HN-Z1 AY789533 Trung Quốc
12 HN-Z3 AY789534 Trung Quốc
13 NJ AY686601 Trung Quốc
14 NJ-2 AY789532 Trung Quốc
15 ZJ EU790642 Trung Quốc
16 BQ EU790641 Trung Quốc
Ghi chú: 10 chủng từ P1-P9, P11 là các chủng PPV của Việt Nam được giải trình tự trong nghiên cứu này.