4.1.1. Tối ưu nồng độ hồng cầu
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngưng kết (HA)/ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) như: loại hồng cầu, nồng độ hồng cầu, thời gian ủ kháng nguyên- hồng cầu, nhiệt độ ủ đĩa, v.v... (Awad et al., 2012, Rasool et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tôi trước tiên tối ưu nồng độ hồng cầu dùng cho phản ứng.Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) được thực hiện với 3 nồng độ hồng cầu chuột lang là 0,5%, 0,6% và 1% để tìm ra nồng độphù hợp nhất. Kết quả được trình bày ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả xác định nồng độ hồng cầu tối ưu
Kháng nguyên PPV được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/1028.
Đối chứng âm (-) không có virus, đối chứng dương (+) gồm virus và hồng cầu.
Ở cả 3 nồng độ hồng cầu đều có hiện tượng ngưng kết ở các độ pha loãng virus thấp (ví dụ từ 1/2 đến 1/32 ở giếng 1 đến giếng 5) và không ngưng kết ở các độ pha loãng virus cao (ví dụ 1/1028, giếng 10).
Ở cùng độ pha loãng virus, nồng độ hồng cầu khác nhau ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng ngưng kết. Ví dụ: hồng cầu 1% hiện tượng ngưng kết hoàn toàn xảy ra ở giếng thứ 5, hồng cầu 0,6% hiện tượng ngưng kết hoàn toàn đến giếng thứ 7, hồng cầu 0,5% hiện tượng ngưng kết hồng cầu hoàn toàn đến giếng thứ 8. Như vậy, nồng độ hồng cầu tối ưu nhất là 0,5%. Số lượng hồng cầu trong dung dịch 0,5% được xác định là Xtb± SD = 203,86±
47,61x104tế bào/ml.
4.1.2. Tối ưu thời gian tương tác giữa huyết thanh- virus
Sau khi trộn đều huyễn dịch PPV chuẩn (pha ở 4 HAU) với huyết thanh dương chuẩn đã pha loãng (1/2 đến 1/512), chúng tôi để thời gian cho kháng thể trung hòa virus là 20 phút, 40 phút, 60 phút, 2 giờ, 4 giờ. Sau thời gian trên, tiến hành cho hồng cầu 0,5% vào các giếng, để 30 phút rồi đọc kết quả (hình 4.2).
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời gian tương tác virus- huyết thanh. Huyết thanh dương chuẩn được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/512
Trong các khoảng thời gian để kháng thể trung hòa virus ta thấy: sau thời gian tương tác 20 phút đến 4 giờ đều có thể quan sát được hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu từ độ pha loãng 1/2 đến 1/8. Ở các độ pha loãng huyết thanh cao (1/16 đến 1/512) đều không còn hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Hiệu giá kháng thể của mẫu huyết thanh dương chuẩn khi ủ với virus trong 5 khoảng thời gian kể trên đều cho giá trị 1/8. Nói cách khác, thời gian tương tác giữa huyết thanh- virus không có ảnh hưởng rõ rệt tới kết quả của phản ứng HI xác định hiệu giá kháng thể kháng PPV. Do đó, chỉ cần ủ huyết thanh cần chẩn đoán với virus trong vòng 20 phút. Việc xác định được thời gian phản ứng này có ý nghĩa trong công tác chẩn đoán, góp phần rút ngắn thời gian thực hiện phản ứng mà không làm ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.
4.1.3. Loại trừ yếu tố ngưng kết trong huyết thanh xét nghiệm
Trong quá trình thực hiện phản ứng HI với mẫu huyết thanh lợn, chúng tôi nhận thấy khi ủ mẫu huyết thanh với hồng cầu, một số mẫu huyết thanh có hiện tượng ngưng kết với hồng cầu (hình 4.3).
Hình 4.3. Hiện tượng ngưng kết hồng cầu của huyết thanh xét nghiệm Ở giếng đối chứng hồng cầu có hiện tượng hồng cầu lắng thành cục tròn dưới đáy giếng, khi nghiêng đĩa thấy hồng cầu chảy thành dòng. Ngược lại, ở các giếng huyết thanh và hồng cầu, chúng tôi thấy có hiện tượng ngưng kết lấm tấm, với các mức độ khác nhau, khi nghiêng đĩa không thấy hiện tượng hồng cầu chảy thành dòng. Nói cách khác, trong huyết thanh có yếu tố gây ngưng kết hồng cầu.
Hiện tượng ngưng kết này có thể do một số yếu tố gây ngưng kết không đặc hiệu và cũng có thể do sự hiện diện của virus gây ngưng kết hồng cầu (ví dụ PPV). Để khắc phục hiện tượng trên, chúng tôi cho huyết thanh hấp phụ hồng cầu 10% qua đêm ở 4oC. Kết quả xử lý được trình bày ở hình 4.4.
Hình 4.4. Kết quả loạibỏ hiện tượng ngưng kết hồng cầucủa huyết thanh Mẫu huyết thanh sau khi hấp phụ với hồng cầu 10% được thử với dung dịch hồng cầu 1%. Hình 4.4 cho thấy ở mẫu thử (huyết thanh + hồng cầu) và đối chứng hồng cầu đều không có hiện tượng ngưng kết (hồng cầu lắng thành cục tròn dưới đáy đĩa, khi nghiêng đĩa có hiện tượng chảy thành dòng). Như vậy, hiện tượng ngưng kết có thể được xử lý bằng cách hấp phụ hồng cầu 10%.
Từ kết quả này, chúng tôi đã xử lý toàn bộ mẫu huyết thanh lợn với hồng cầu 10% trước khi thực hiện phản ứng HI phát hiện kháng thể kháng PPV.