4.3.1. Kết quả PCR phát hiện PPV trong mẫu huyết thanh
Một số nghiên cứu đã công bố cho thấy sự có mặt của PPV trong máu không phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng PPV (Dias, 2013, Streck, 2011). Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi chọn ở mỗi tỉnh 3 mẫu huyết thanh có hiệu giá HI khác nhau để nghiên cứu sự lưu hành virus huyết bằng phương pháp PCR. Kết quả PCR để xác định sự có mặt của PPV trong các mẫu huyết thanh được minh họa ở hình 4.11 và tổng hợp ở bảng 4.4.
Hình 4.11. Minh họa kết quả phản ứng PCR phát hiện PPV. M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch là 100bp
Các mẫu huyết thanh xét nghiệm số 5 đến số 8.Các vạch sản phẩm PCR không đặc hiệu được đánh dấu “*”, “**”. Vạch sản phẩm đặc hiệu (265 bp) được đánh dấu bởi ký hiệu “>”.
Kết quả ở hình 4.11 cho biết, ở các mẫu số 5, 6 và 7 xuất hiện vạch đặc hiệu với kích thước 265 bp. Mẫu số 8 xuất hiện một số vạch PCR có kích thước không đặchiệu và được đánh giá là âm tính. Như vậy, bằng phản ứng PCR, chúng tôi đã xác định được sự có mặt của PPV trong mẫu huyết thanh. Tổng hợp kết quả xét nghiệm được trình bày ở bảng 4.4.
Kết quả tổng hợp ở bảng 4.4 cho biết trong 18 mẫu huyết thanh xét nghiệm, có 10/18 mẫu dương tính với PPV và có 8/18 mẫu âm tính với PPV.
Bằng phân tích phương sai (ANOVA) chúng tôi nhận xét rằng hàm lượng kháng thể giữa nhóm lợn có virus huyết (PCR dương tính) và nhóm lợn không có virus huyết (PCR âm tính) không có sự khác biệt (giá trị F lý thuyết = 1,59< F thực nghiệm ở mức p= 0,22 > 0,05).
Bảng 4.4. Kết quả PCR phát hiện PPV trong huyết thanh
TT Ký hiệu Hiệu giá HI
(1/x) PCR Ký hiệu
trình tự gen NS1
1 VP2-12 /512 + P1
2 VP2-13 /64 + P2
3 VP2-15 /8 + P3
4 BN2-17 /64 + P4
5 BN2-18 /4 + P5
6 BN11-45 /128 + P6
7 HY12-41 /16 + P7
8 HY12-42 /32 -
9 HY12-45 /256 + P8
10 HB14-0403 /128 -
11 HB15-0401 /16 -
12 HB15-0405 /8 -
13 HN15-42 /16 -
14 HN18-0401 /32 -
15 HN18-0406 /512 -
16 HD18-45 /32 -
17 HD2-15 /16 + P9
18 HD2-195 /8 + P11
Bên cạnh kết quả xác định sự lưu hành PPV bằng phản ứng huyết thanh học, kết quả PCR đã khẳng định có sự lưu hành virus ở các nhóm lợn được lấy mẫu trong nghiên cứu này. Kết quả nghiên cứu thu được của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với kết luận của Streck và cộng sự (Streck, 2011) khi cho biết PPV có thể lưu hành ở lợn được nuôi dưới nhiều phương thức chăn nuôi khác nhau và không phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể dịch thể đặc hiệu.
4.3.2. Kết quả phân nhóm PPV lưu hành bằng giải trình tự gen
Để làm rõ hơn đặc điểm của các chủng PPV trong nhóm mẫu được xét nghiệm,chúng tôi đã tiến hành giải trình tự phân đoạn gen NS1 của 10 chủng PPV (đã trình bày ở bảng 4.4). Kết quả ở hình 4.12 cho thấy 10 chủng PPV thực địa ở Việt Nam có trình tự phân đoạn gen NS1 ít thay đổi, với mức tương đồng rất cao từ 99,7% đến 100%. So với các chủng tham chiếu mức tương đồng về trình tự gen là 96,5% đến 99,6%.
Hình 4.12. Trình tự nucleotide của gen mã hóa protein NS1
Dấu “.” biểu thị các vị trí có nucleotide giống với chủng tham chiếu là SD-68. P1-P11 là trình tự gen của các chủng PPV ở Việt Nam thu được trong nghiên cứu này.
Như vậy, kết quả PCR và kết quả giải trình tự đã khẳng định sự lưu hành của PPV ở đàn lợn nuôi tại các địa phương lấy mẫu. Mối quan hệ di truyền giữa các chủng PPV thực địa được xác định bằng phương pháp phân tích cây phát sinh chủng loại. Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại (hình 4.13) đã xác định 10 chủng PPV được giải trình tự trong nghiên cứu này thuộc về nhóm 1, bao gồm các chủng châu Mỹ (American strain, ví dụ: NADL-2, POVG, Kresse), chủng Trung Quốc (Chinese strain, ví dụ: SR-1, BQ, NJ) và chủng Hàn Quốc (Korean strain, VRI-1). Đặc điểm phân loại dựa vào trình tự gen NS1 thu được trong nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với cách phân loại tương tự đã được công bố (Hao, 2011).
1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570
| . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . AY502114_SD-68 GTTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATAAACCTAACCAGAAAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGA D00623_POVG ...
M32787_POVCAP ...
M38367_POVNADL-2 ...
U44978_Kresse ...
NC_001718_NADL-2 ...
AY390557_VRI-1 ...
AY739664_Nanjin-1 ...
AY789532_NJ-2 ...
AY789533_HN-Z1 ...
AY789534_HN-Z3 ...
AY684869_Tornau ...T...C...A...A...
AY684871_27a ...
AY684872_IDT ...C...A...A...
AY686601_NJ ...
DQ675456_SR1 ...G...
EU790641_BQ ...
EU790642_ZJ ...
P1 ...
P2 ...
P3 ...
P4 ...
P5 ...
P6 ...
P7 ...
P8 ...
P9 ...
P11 ...
1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680
| . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . AY502114_SD-68 AACTGAATGGCCACTAATATGTGCTTGGTTGGTAAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCATCATTGGGGAAATGTACCTGATTGGTCCGAAAAATGGG D00623_POVG ...A...
M32787_POVCAP ...A...
M38367_POVNADL-2 ...A...
U44978_Kresse ...
NC_001718_NADL-2 ...A...
AY390557_VRI-1 ...A...A...A AY739664_Nanjin-1 ...T...A...
AY789532_NJ-2 ...G...T...A...
AY789533_HN-Z1 ...T...A...
AY789534_HN-Z3 ...T...A...
AY684869_Tornau ...C...A...
AY684871_27a ...A....G...
AY684872_IDT ...T...A...
AY686601_NJ ...
DQ675456_SR1 ...A...
EU790641_BQ ...A...
EU790642_ZJ ...A...
P1 ...A...
P2 ...A...
P3 ...A...
P4 ...A...
P5 ...A...
P6 ...A...
P7 ...A...
P8 ...A...
P9 ...A...
P11 ...A...
Hình 4.13. Cây phát sinh chủng loại của PPV