3. Đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rifampicin trong huyết t−ơng
3.3.1.1. Xây dựng ph−ơng pháp định l−ợng rifampicin trong huyết t−ơng.
Có nhiều phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương, chúng tôi chọn phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do phương pháp này có độ chính xác cao, thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận đ−ợc. Ph−ơng pháp chiết rifampicin và ch−ơng trình sắc ký đ−ợc nghiên cứu nh− sau:
Ph−ơng pháp chiết: Mẫu rifampicin chuẩn trong huyết t−ơng đ−ợc nghiên cứu chiết với các loại dung môi khác nhau để tìm ra dung môi có hiệu suất chiết cao.
Ch−ơng trình sắc ký Cột sắc ký:
Khảo sát khả năng tách và định lượng rifampicin trong huyết tương trên cột phù hợp, có khả năng tách rifampicin ra khỏi mẫu phân tích
Pha động
Tiến hành khảo sát nhiều hệ pha động khác nhau dựa vào các nghiên cứu trước và độ tan của rifampicin trong dung môi với các tỉ lệ khác nhau để tìm ra hệ pha
động có khả năng tách rifampicin ra khỏi mẫu phân tích và có thời gian lưu hợp lý.
B−íc sãng
Tiến hành quét phổ rifampicin, tìm bước sóng hấp thụ để xác định bước sóng ph©n tÝch.
Lưu lượng dòng
Thay đổi lưu lượng dòng từ 0,7 đến 1,5 ml/phút để tìm lưu lượng dòng thích hợp, có thể tách riêng pic của rifampicin ra khỏi pic tạp và thời gian phân tích hợp lý.
Thể tích tiêm
Thử với một số thể tích tiêm từ 20 - 50 àl để tìm thể tích tiêm cho diện tích pic phù hợp.
3.3.1.2. Thẩm định ph−ơng pháp định l−ợng
Sau khi xác định được phương pháp định lượng rifampicin chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo các chỉ tiêu sau:
Tính đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu huyết t−ơng trắng (huyết t−ơng không có rifampicin), mẫu chuẩn (huyết tương trắng + rifampicin nồng độ 10 àg/ml), mẫu chuẩn (mẫu huyết t−ơng có chứa rifampicin, isoniazid, pyrazinamid) và mẫu thử (mẫu huyết t−ơng bệnh nhân 2 giờ sau khi uống hỗn hợp rifampicin, isoniazid, pyrazinamid).
Các mẫu được xử lý, chạy sắc ký, so sánh sắc đồ của mẫu huyết tương trắng, mẫu chuẩn rifampicin trong huyết t−ơng và mẫu huyết t−ơng bệnh nhân uống hỗn hợp R-H-Z để xác định tính đặc hiệu của phương pháp.
Độ đúng: Xác định bằng phương pháp thêm.
Pha 10 mẫu rifampicin trong huyết tương với nồng độ 8 àg/ml, 5 mẫu đầu thêm chính xác vào mỗi mẫu 4 àg, 5 mẫu sau thêm vào mỗi mẫu 8 àg. Tiến hành xử lý, chạy sắc ký, tính tỉ lệ tìm lại rifampicin từ diện tích pic theo công thức sau:
Tổng l−ợng RMP - L−ợng RMP ban đầu
% rifampicin tìm lại = x 100%
L−ợng RMP thêm vào
Độ chính xác
Pha mẫu chuẩn với nồng độ 8 àg/ml, tiến hành xử lý mẫu, chạy sắc ký mẫu 5 lần. Đánh giá độ chính xác qua kết quả đo đ−ợc.
Hàm đáp ứng
Pha dãy nồng độ rifampicin chuẩn trong huyết tương từ 1 đến 30 àg/ml, tiến hành xử lý mẫu, chạy sắc ký. Nghiên cứu sự phụ thuộc của diện tích pic thu đ−ợc với nồng độ rifampicin. Sự phụ thuộc là tuyến tính chặt khi hệ số tuyến tính r gần 1.
Giới hạn định l−ợng
Từ mẫu huyết tương có nồng độ 1àg/ml, pha loãng nhiều lần để được các nồng
- Đáp ứng pic tại giới hạn định l−ợng thấp nhất ≥ 5 lần so với đáp ứng pic t−ơng ứng ở mẫu trắng (nếu có)
- Pic của chất phân tích tại giới hạn định l−ợng thấp nhất có tính xác định, phân biệt, tái hiện với độ chính xác có hệ số biến thiên không quá 20%.
Độ ổn định của mẫu phân tích
Mẫu huyết t−ơng bệnh nhân uống rifampicin đ−ợc bảo quản trong ống nghiệm nhựa, nút kín, ở nhiệt độ - 40OC trong khoảng thời gian 3 tháng. Tại thời điểm một tháng, hai tháng, ba tháng, mẫu đ−ợc lấy ra phân tích tìm hàm l−ợng còn lại sau thời gian bảo quản để xác định độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tương.
3.3.2. Nghiên cứu sinh khả dụng của RMP 3.3.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu ngẫu nhiên, liều đơn, so sánh chéo ba, ba giai đoạn trên người tình nguyện.
Thiết kế nghiên cứu ngẫu nhiên:
Ng−ời tình nguyện đ−ợc bố trí ngẫu nhiên thành 3 nhóm thử nghiệm nh−
sau:
- 12 người tình nguyện được mã hoá từ A đến M.
- Chuẩn bị 12 phiếu bốc thăm: 4 phiếu đề “nhóm 1”, 4 phiếu đề “nhóm 2”, 4 phiếu
đề “nhóm 3”.
- Cho người tình nguyện bốc thăm để phân ngẫu nhiên 12 người thành 3 nhóm - Kết quả:
Nhóm 1: gồm 4 ng−ời tình nguyện có mã A, D, E, F.
Nhóm 2: gồm 4 ng−ời tình nguyện có mã B, C, K, L.
Nhóm 3: gồm 4 ng−ời tình nguyện có mã G, H, I, M.
Thiết kế nghiên cứu chéo ba, ba giai đoạn:
Mỗi người tình nguyện đều trải qua 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn uống một trong các thuốc sau:
- Rifampicin đơn độc (R)
- Rifampicin- isoniazid- pyrazinamid 3 loại riêng rẽ (R-H-Z).
- Viên Combikit (RH+Z)
Trình tự các giai đoạn thử nghiệm của các nhóm nh− sau:
Bảng 3.2. Bố trí các giai đoạn thử nghiệm theo từng nhóm Giai đoạn Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III
Nhãm 1 R RH +Z R-H-Z
Nhãm 2 RH+Z R-H-Z R
Nhãm 3 R-H-Z R RH +Z
Mỗi giai đoạn thử nghiệm cách nhau một tuần. Số viên thuốc cho mỗi liều đơn nh− trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số viên thuốc cho mỗi liều
Tên th−ơng mại Thành phần Số viên
1 Combikit® RH-Z 3-3
2 Eremfat® 150 R 3
3 Rimifon® H 2
4 PZA-CIBA® Z 3
3.3.2.2. Mô tả ph−ơng pháp tiến hành
Trước khi tiến hành nghiên cứu, đề cương chi tiết đã được thông qua tại Hội
đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội xem xét, chấp thuận và cho phép tiến hành. (Phụ lục 7)
Các dữ liệu thu đ−ợc trên ng−ời tình nguyện đ−ợc ghi vào 1 phiếu theo mẫu.
(Phô lôc 1)
Lựa chọn ng−ời tình nguyện:
- Ng−ời khoẻ mạnh tình nguyện tham gia thử nghiệm đ−ợc thăm khám lâm sàng, làm xét nghiệm cần thiết (sinh hoá, huyết học, nước tiểu, HIV, HBV) để lựa chọn đối t−ợng đủ tiêu chuẩn nghiên cứu. Những đối t−ợng đủ tiêu chuẩn có ký cam kết tình nguyện mới thu nhận vào nghiên cứu.
Địa điểm khám lâm sàng, uống thuốc và lấy mẫu máu:
- Địa điểm khám lâm sàng, làm xét nghiệm, uống thuốc, lấy máu và theo dõi trong quá trình thử nghiệm tại Bệnh viện Việt Nam - Cuba.
- Theo dõi, lấy máu và xử trí cấp cứu các tình huống bất th−ờng trong quá trình thử nghiệm do bác sĩ và y tá đảm nhận.
Cho ng−ời tình nguyện uống thuốc:
- Cho uống thuốc là ng−ời của nhóm nghiên cứu.
- Ngày tr−ớc khi uống thuốc, ăn tối muộn nhất vào lúc 18h. Sáng hôm sau nhịn ăn sáng. Thuốc được uống lúc 7h với 200 ml nước (nước tinh khiết đóng chai).
Đ−ợc ăn nhẹ lúc 9h. ăn tr−a vào lúc 11h sau khi lấy mẫu máu giờ thứ 4.
Tiến hành lấy mẫu máu:
− Mẫu đ−ợc lấy nh− sau: 0h (tr−ớc khi uống thuốc), 30', 45’, 60', 90', 2h, 2h30, 3h, 4h, 8h, 12h, 24h.
- Số l−ợng máu của mỗi mẫu là 5 ml, máu tĩnh mạch, chống đông bằng heparin;
trong vòng 15 phút sau khi lấy máu, ly tâm để tách huyết tương. Mỗi mẫu máu tách thành 2 mẫu huyết tương (1ml/mẫu), 1 mẫu để phân tích nồng độ rifampicin, mẫu còn lại để dự trữ sau khi phân tích số liệu, nếu nghi ngờ có thể phân tích lại.
- Huyết t−ơng tách ra cho vào ống nghiệm bằng nhựa, nút kín, dán nhãn có mã
hoá mẫu, bảo quản trong tủ lạnh sâu - 40oC cho đến khi định l−ợng. Thời gian bảo quản mẫu tối đa 1 tháng.
Phân tích định lượng nồng độ RMP bằng phương pháp HPLC
Sử dụng phương pháp định lượng RMP huyết tương đã được xây dựng và thẩm
định phương pháp để định lượng RMP trong các mẫu huyết tương.
Đánh giá t−ơng đ−ơng sinh học của RMP từ viên Combikit:
Từ nồng độ đo được, xây dựng đường cong nồng độ - thời gian của mỗi dạng chÕ phÈm.
Tính các thông số d−ợc động học của mỗi dạng chế phẩm (AUCt, AUC0-∞, Cmax, Tmax, T1/2 ).
So sánh AUCt, AUC0-∞, Cmax, Tmax, T1/2 của RMP từ viên Combikit với dạng uống đơn lẻ và uống 3 viên phối hợp R-H-Z.
3.3.3. Ph−ơng pháp thống kê, xử lý số liệu 3.3.3.1. Tính các thông số d−ợc động học
Sử dụng phần mềm chuyên dụng WINNOLIN 2.1 để tính toán các thông số d−ợc động học RMP dựa trên các số liệu đo đ−ợc từ thực nghiệm. Các thông số d−ợc
động học chính cần xác định là:
- Tmax - Thời gian đạt Cmax.
Hai thông số Cmax, Tmax lấy trực tiếp từ số liệu của thực nghiệm.
- AUCt - diện tích dưới đường cong nồng độ thời gian từ thời điểm 0 đến t giờ, theo qui tắc hình thang.
AUCt= ⎟
⎠
⎜ ⎞
⎝
⎛ + −
+ ∑
=
+ t +
i
i i i
i C t t
t C C
2
1 1 1
1
2
) ).(
( 2
.