1.2.6.1. Các kỹ thuật lấy bệnh phẩm:
Lấy bệnh phẩm là yếu tố rất quan trọng để chẩn đoán xác định bệnh thận.
Yêu cầu phải tuân thủ đúng ph-ơng pháp mới cho kết quả chính xác. Bao gồm các cách lấy bệnh phẩm nh- sau:
LÊy n-íc tiÓu 24 giê:
Lấy toàn bộ l-ợng n-ớc tiểu trong một ngày đêm (đủ 24 giờ).
Chỉ định: định l-ợng protein niệu/ 24h.
Cách tiến hành:
- Tối hôm tr-ớc tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục – tiết niệu, chuẩn bị bô có nắp đậy đựng n-ớc tiểu, bô đ-ợc rửa sạch, tráng 5 ml dung dich HCL
đậm đặc để sát khuẩn.
- 6 h sáng bệnh nhân đái bỏ đi, và bắt đầu ghi thời gian. L-u ý l-ợng n-ớc uống trong ngày: nếu có phù thì l-ợng n-ớc uống bằng số l-ợng n-ớc tiểu trong 24h + 500 ml do n-ớc mất qua da và hơi thở, nếu không phù thì uống khoảng 2 l/ngày.
- Sau đó cả ngày và đêm n-ớc tiểu đựng vào bô, kể cả l-ợng n-ớc tiểu lúc
đại tiện cũng phải gom cho vào.
- 6h sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô.
Đo số l-ợng n-ớc tiểu trong bô (thể tích n-ớc tiểu 24h), ghi vào giấy xét nghiệm và bệnh án. Lấy 10 ml mang tới labô xét nghiệm.
Lấy mẫu n-ớc tiểu buổi sáng:
Là ph-ơng pháp áp dụng thông th-ờng nhất vì thuận tiện, đơn giản, tỷ lệ chính xác cao. Vì l-ợng n-ớc tiểu đ-ợc cô đặc sau một đêm ngủ, các thành phần bất th-ờng bệnh lý, kể cả vi khuẩn niệu sẽ có tỷ lệ cao nên dễ phát hiện.
Cách tiến hành:
Sáng sớm, bệnh nhân vệ sinh bộ phận sinh dục - tiết niệu tr-ớc khi lấy n-ớc tiểu. Đi tiểu phần đầu bãi bỏ đi, rồi hứng vào 1 hoặc 2 ống nghiệm (theo yêu cầu) mỗi ống từ 5 - 10 ml n-ớc tiểu gửi đi xét nghiệm.
1.2.6.2. Các kỹ thuật định l-ợng protein.
Phân tích định l-ợng protein toàn phần n-ớc tiểu đ-ợc phân loại thành 3 ph-ơng pháp chính: ph-ơng pháp hoá học, đo độ đục và ph-ơng pháp sử dụng các thuốc nhuộm.
Ph-ơng pháp hoá học:
Phản ứng biuret.
Phản ứng sử dụng thuốc thử biure (các ion Cu2+ trong dung dịch kiềm) cùng với các liên kết peptid của protein sẽ tạo phức hợp màu có độ hấp phụ đo ở b-ớc sóng 540 nm. Vì phản ứng biure đ-ợc coi là không nhạy cảm và đôi khi bị nhiễu khi áp dụng trực tiếp trên n-ớc tiểu, protein th-ờng đ-ợc cô đặc tr-ớc khi phân tích. Tiến hành kết tủa protein với trichloroacetic acid (TCA) hoặc ethanolic hydrochloric phosphotungstic acid, sau đó ly tâm để cô đặc, protein
đ-ợc hoà tan trở lại và phản ứng với thuốc thử biure (độ nhạy 5 - 17 mg/l).
Phản ứng Lowry (Folin-Lowry).
Phản ứng có độ nhạy 10 mg/l cao gấp 100 lần so với phản ứng biure cổ
điển, nó cũng đã đ-ợc áp dụng để định l-ợng protein trong n-ớc tiểu sau b-ớc tinh sạch để loại bỏ các chất gây nhiễu trong n-ớc tiểu. B-ớc đầu tiên của ph-ơng pháp này là sự t-ơng tác của các ion Cu2+ giống nh- trong phản ứng biure, là sự gắn các ion Cu2+ với liên kết peptid và các acid amintyrosin và tryptophan trong môi tr-ờng kiềm. Sau đó thuốc thử Folin (gồm phosphotungstic và phosphomlydic acid đ-ợc hoà tan trong acid phosphoric và hydrochloric)
đ-ợc thêm vào, oxy hoá phức hợp Cu2+- protein và Cu+- tyrosin và phức hợp Cu+- tryptophan và kết tủa các acid phosphotungstic và phosphomolybdic tạo ra
molybdenum xanh da trời và tungsten xanh da trời, có phổ hấp thụ cực đại khá
rộng nh-ng th-ờng đ-ợc đo ở b-ớc sóng 660 nm.
Ph-ơng pháp đo độ đục.
Trong ph-ơng pháp đo độ đục, chất kết tủa protein là các acid nh- TCA, benzenthonium chloride (độ nhạy 10 mg/l) hoặc ammonium chloride đ-ợc thêm vào mẫu làm kết tủa protein trong mẫu, các protein kết tủa này bị biến tính hình thành các hạt giống nh- huyền phù treo lơ lửng. Độ đục thay đổi khác nhau đáng kể, phụ thuộc vào hoá tính, nồng độ của acid gây kết tủa, các loại protein, nhiệt
độ và thời gian giữa thêm acid và thời gian đo độ đục.
Ph-ơng pháp sử dụng các thuốc nhuộm.
Năm 1973, Pesce và Strande [28] phát triển một kỹ thuật để xác định protein trong n-ớc tiểu dựa trên sự hình thành của một phức hợp protein - thuốc nhuộm với Ponceau S (độ nhạy 20 mg/l). Mẫu đ-ợc trộn với một dung dịch thuốc nhuộm TCA - Ponceau tạo thành các phức hợp protein - thuốc nhuộm kết tủa. Các kết tủa màu đỏ này đ-ợc hoà tan trong dung dịch NaOH loãng tạo thành dung dịch có màu tím, đ-ợc đo phổ hấp thụ ở b-ớc sóng 560nm. Màu sắc đ-ợc ổn định trong vòng 6h ở nhiệt độ phòng. Salo và Honkavaara đã sửa đổi một số việc để v-ợt qua những khó khăn trong việc loại bỏ các chất gạn của thuốc nhuộm mà cũng bắt màu mạnh [32]. Họ giảm nồng độ của cả TCA và Ponceau S tinh khiết bằng biện pháp đơn giản là đo độ giảm độ hấp phụ ở b-ớc sóng 520 nm của các dung dịch tinh khiết sau khi bổ sung các mẫu, tiếp theo là ly tâm.
Một ph-ơng pháp thứ ba là sử dụng thuốc nhuộm của Ponceau S đã đ-ợc giới thiệu bởi Meola cùng cộng sự [22], protein đ-ợc hấp phụ vào bột cellulose, rồi thêm vào thuốc nhuộm Ponceau S để gắn kết với protein đã hấp phụ tạo thành phức hợp.Thuốc nhuộm d- thừa đ-ợc rửa sạch với dung dịch acid acetic loãng.
Phức hợp đ-ợc hoà tan trong dung dịch NAOH loãng và đo phổ hấp thụ cực đại tại b-ớc sóng 550 nm.
Năm 1976, Bradford [9] đã đề xuất việc sử dụng thuốc nhuộm Commassive Brilliant Blue G - 250 để -ớc tính các protein có nồng độ thấp (độ nhạy 2,5 mg/l). Thuốc nhuộm gắn kết với protein gây ra sự thay đổi của độ hấp phụ dao động từ 465 nm (từ màu đỏ) đến 595 nm (tới màu xanh). Độ tăng độ hấp phụ ở 595 nm đ-ợc dùng để theo dõi mức độ phản ứng. Quá trình gắn kết diễn ra trong 2 phút và màu sắc đ-ợc ổn định trong 1giờ. Ph-ơng pháp này đã đ-ợc vận dụng trong phân tích tự động [38].
Ph-ơng pháp nhuộm sử dụng đỏ _ pyrogallol molybdate lần đầu tiên mô tả
vào năm 1986 do Watanabe và cộng sự [27]. Trong ph-ơng pháp này, sự lên màu của phản ứng giữa phức hợp đỏ _ pyrogallol molybdate và protein gây ra một sự dịch chuyển trong phổ hấp thụ từ 460 lên 600 nm, tỷ lệ thuận với nồng độ protein toàn phần trong n-ớc tiểu (độ nhạy 10 mg/l). Mẫu n-ớc tiểu và thuốc nhuộm pyrogallol đỏ - molybdate đ-ợc ủ ở 37oC trong 10 phút. Ph-ơng pháp cho thấy sự t-ơng quan với ph-ơng pháp biure với nồng độ của albumin, nh-ng lại kém nhay so với việc xác định γ - globulin. Vấn đề này đã đ-ợc khắc phục bằng cách cho thêm vào phản ứng dung dịch dodecyl sulphate (SDS). Phức hợp pyrogallol đỏ - molybdate và SDS cạnh tranh với acid amin kiềm tại pH = 2,5.
Hơn nữa, SDS làm biến tính các chuỗi polypeptid, phơi bày thêm các amino acid kiềm. Kết quả cuối cùng là sự lên màu của γ - globulin giống nh- albumin.
Que thử và hệ hoá chất khô.
Que thử đ-ợc sử dụng một cách rộng rãi, có thể áp dụng đ-ợc ngay tại chỗ chăm sóc bệnh nhân. Que thử là mảnh cellulose thấm dung dịch đệm citrat và tetrabromophenol xanh lá cây (pH = 3). Nếu xuất hiện protein, tetrabromphenol trên mảnh giấy sẽ chuyển thành màu xanh lá cây tại pH = 3 và vẫn còn màu vàng nếu không có protein. Màu sắc đ-ợc đọc sau 1 phút, với giới hạn phát hiện thấp hơn 150 - 300 mg/l (độ nhạy 150 mg/l).
Ph-ơng pháp xác định protein toàn phần n-ớc tiểu sử dụng các thuốc nhuộm hoá học với công nghệ bản khô phân tích trên máy tự động đã có trên thị tr-ờng. Trong ph-ơng pháp này, protein trong mẫu gắn với pyrocatechol tím - molybdate, tạo thành một phức hợp có độ hấp phụ cực đại thay đổi. Xác định protein n-ớc tiểu toàn phần sử dụng pyrocatechol tím - molybdate đã đ-ợc coi là t-ơng đồng với hai ph-ơng pháp pyrogallol đỏ - molybdate và ph-ơng pháp biuret [18,20].
Ph-ơng pháp quy chiếu.
Không có ph-ơng pháp nào đ-ợc công nhận là ph-ơng pháp tham chiếu hoặc là tiêu chuẩn để đo protein toàn phần trong n-ớc tiểu. Đo l-ờng protein toàn phần trong n-ớc tiểu là khó khăn hơn so với trong huyết thanh. Nồng độ của protein n-ớc tiểu th-ờng thấp (100 - 200 mg/l) và nó th-ờng xuyên có sự biến
đổi lớn từ mẫu này sang mẫu khác về số l-ợng và thành phần protein. Thêm vào
đó, nồng độ của các chất không phải là protein t-ơng đối cao trong khi nồng độ protein lại khá là thay đổi, cùng với hàm l-ợng các ion vô cơ cũng khá lớn.Tất cả
những yếu tố này ảnh h-ởng tới tính chính xác và độ xác thực của các ph-ơng pháp đo l-ờng protein n-ớc tiểu khác nhau.