1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật)
1.3.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro
Nhân giống vô tính cây trồng thường trải qua các bước sau:
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Tạo thể nhân giống in – vitro
Nhân giống in – vitro
Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in – vitro
Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa
Nhân giống in – vitro
Tạo cây con bầu đất.
Đưa các cây ra đồng ruộng
Chọn lọc cây đầu dòng.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới
15
nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi trường Murashige và Skoog. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l)
Tạo thể nhân giống in – vitro:
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in – vitro. Có hai thể nhân giống in – vitro : thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có tiền củ (protocorm). Tạo thể nhân giống in –vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
Nhân giống in – vitro:
Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng.
Cây nhân giống in – vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn.
Tái sinh cây hoàn chỉnh in – vitro:
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm đảm bảo sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in – vitro. Thường dùng các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ.
Chuyển cây in – vitro ra vườn ươm:
16
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính.
Cây in - vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ.
Nhân giống ex – vitro:
Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7-10 ngày thì bắt đầu ra rễ. sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho mỗi loại). Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái tốt nhất bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp…Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý nghĩa.
Cây con bầu đất:
Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15-20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1-2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N- P- K:
20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát để cây phát triển nhanh và khỏe.
17
Trồng cây ra ruộng:
Cây con sau khi đạt được kích thước về chiều cao, số lá đường kính thân thích hợp sẽ được chuyển ra trồng ở đồng ruộng. Duy trì độ ẩm cao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán.
Chọn lọc cây đầu dòng:
Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô.
Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu.