2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 04 đến tháng 06 năm 2010 tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu:
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp. Được cung cấp từ Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật trực thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới.
Nguồn mẫu được sử dụng cho các thí nghiệm trong nghiên cứu là những PLB độc lập, nguyên vẹn. Loại bỏ các PLB đã phát triển thành chồi.
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ:
Thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng Autoclave, máy đo pH, cân phân tích, máy lạnh, kệ đặt bình, đèn huỳnh quang, máy phun khí,...
Dụng cụ: dao cấy, đèn cồn, đĩa petri, bình erlen, bình thủy tinh 500ml, pipet,...
Hệ thống bireactor tự tạo.
2.2.3. Môi trường nuôi cấy:
Môi trường sử dụng là môi trường muối khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) dạng dung dịch, với khoáng đa lượng (NH4NO3, KNO3, Mg2SO4, CaCl2, KH2PO4) được giảm một nữa. Các muối trung, vi lượng (MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KI, CoCl2.6H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, Na2EDTA, FeSO4.7H2O) và các vitamin ( Myo – inositol, Nicotinic acid, Pyridoxine HCl, Thiamine HCl, Glycine) vẫn giữ nguyên hàm lượng ban đầu.
Các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường gồm có BA và NAA.
Ngoài ra còn bổ sung nước dừa non với hàm lượng 20% (v/v).
Môi trường được hấp khử trùng trong nồi Autoclave ở điều kiện : nhiệt đô 121oC, áp suất 1 atm và trong thời gian 15 phút.
30
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in – vitro:
Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ ngày.
Cường độ chiếu sáng: 2500 lux.
Nhiệt độ : 25 ± 2oC.
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm:
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB Lan Hồ Điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.).
Mục đích thí nghiệm:
Thí nghiệm nhằm xác định được môi trường tối ưu nhất nhằm nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng. Nhằm đạt được hệ số nhân giống cao nhất.
Tiến hành thí nghiệm:
Mụi trường được sử dụng trong thớ nghiệm: MS ẵ được bổ sung hai chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA theo bảng sau:
Bảng 2.1: Mụi trường MS ẵ bổ sung BA và NAA ảnh hưởng lờn sự nhõn nhanh PLB Mãn Thiên Hồng.
Môi trường BA (mg/l) NAA (mg/l)
MS 1 MS 1.1 4 0.3
MS 1.2 4 0.5
MS 2 MS 2.1 6 0.3
MS 2.2 6 0.5
MS 3 MS 3.1 8 0.3
MS 3.2 8 0.5
MS 4 MS 4.1 10 0.3
MS 4.2 10 0.5
Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 10 lần.
10 PLB riêng rẽ được cấy vào bình thủy tinh chứa 50 ml môi trường vô trùng được bổ sung BA và NAA theo bảng 2.1.
31
Sau 6 tuần nuôi cấy, xem xét quá trình nhân PLB và thu số liệu.
Sau đó đánh giá, xử lý số liệu để xác định môi trường nhân PLB tối ưu nhất.
Môi trường được xác định là tối ưu nhất sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tiếp sau.
Chỉ tiêu theo dõi:
Số lượng PLB hình thành và tổng trọng lượng của PLB sau 6 tuần nuôi cấy.
2.3.2. Thí nghiệm 2: So sánh khả năng nhân PLB Mãn Thiên Hồng trong 3 hệ thống khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc.
Mục đích nghiên cứu:
Thí nghiệm này nhằm xác định được hệ thống nuôi cấy tốt nhất cho sự nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng.
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần.
Cấy 10 PLB vào trong 50 ml môi trường vô trùng. Đối với hệ thống rắn, môi trường được chứa trong bình thủy tinh. Đối với hệ thống lỏng tĩnh và lỏng lắc, môi trường được chứa trong bình erlen 250 ml.
Sau 6 tuần nuôi cấy, xem xét quá trình nhân PLB và thu số liệu.
Sau đó đánh giá, xử lý số liệu để xác định hệ thống nhân nhanh PLB tối ưu nhất.
Chỉ tiêu theo dõi:
Số lượng PLB hình thành và tổng trọng lượng của PLB sau 6 tuần nuôi cấy.
2.3.3. Thí nghiệm 3: Bước đầu thử nghiệm khả năng nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng bằng hệ thống Bioreactor tự tạo.
Mục đích nghiên cứu:
Thí nghiệm nhằm ứng dụng hệ thống nhân giống mới trong điều kiện nuôi cấy lỏng có sục khí.
32
Tiến hành thí nghiệm:
Bioreactor tự tạo được hấp vô trùng bằng nồi hấp autoclave.
Sau đó cho vào bình 500 ml môi trường vô trùng.
Môi trường được dùng là tối ưu nhất trong thí nghiệm một.
Chỉ tiêu theo dõi:
Số lượng PLB hình thành và tổng trọng lượng của PLB sau 6 tuần nuôi cấy.
2.4. Phân tích thống kê:
Số liệu thu nhân được từ các nghiệm thức được xử lý bằng chương trình thống kê STATGRAPHICS Centurion XV.I.
Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (bằng phương pháp LSD).
33