1.4.1. Giới thiệu:
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Đầu thế kỉ 21, hàng loạt các công ty về vi nhân giống cây trồng thương mại với quy mô lớn lần lượt ra đời. Tuy nhiên, số công ty thu được lợi nhuận cao vẫn không nhiều. Nguyên nhân chủ yếu là do chi phí cao cho người lao động để thực hiện các công đoạn như cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy. Chính vì vậy, cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thời gian và công lao động. Một trong những hệ thống tự động được nhiều công ty vi nhân giống thực vật trên thế giới sử dụng là hệ thống nuôi cấy bioreactor do Takayama đề ra vào năm 1981.
22
Bioreator đã từng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp vi sinh, sản xuất các hoạt chất sinh học có nguồn gốc từ động vật và thực vật. Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được báo cáo đầu tiên vào năm 1981 với nghiên cứu của tác giả Takayama trên đối tượng là cây Begonia (Takayama và Misawa, 1981). Về sau, hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loài thực vật khác (Takayama, 1991).
Bioreactor được mô tả là một bình phản ứng có những tính chất sau: nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy trong môi trường lỏng, số lượng mẫu cấy nhiều, có khả năng tự động hóa, vi tính hóa thông qua vi điều khiển các yếu tố môi trường như mức khuấy trộn, thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH, v.v… (Paek và cộng sự, 2005).
1.4.2. Cấu trúc và phân loại bioreactor:
1.4.2.1. Cấu trúc bioreactor:
Có nhiều kiểu bioreactor khác nhau, chúng được phân biệt theo:
phương pháp khuấy, kiểu bầu chứa, kiểu sục khí, chế độ chiếu sáng (Takayama, 1991).
Xét về cấu tạo chung, bioreator nuôi cấy mô thực vật cũng giống bioreactor nuôi cấy tế bào động vật hay vi sinh vật.
Vào khoảng cuối năm 1950, các nhà khoa học đã thiết kế nhiều kiểu bồn lên men (fermenter). Các kiểu đơn giản được thiết kế vào năm 1059, bao gồm bình 20 lít. Bình này có một nút cao su lớn và 4 ống nhỏ (ống cho khí vào, ống khí ra, ống môi trường vào, ống lấy mẫu ra). Hiện nay, tuy kích thước bioreactor nuôi cấy tế bào thực vật không ngừng tăng lên nhưng cấu trúc của chúng vẫn tương tự các bồn lên men vi sinh vật.
Bioreactor là một mô hình nuôi cấy phù hợp nhất cho nuôi cấy mô thực vật trong việc sản xuất nhanh một số lượng lớn cây con trong một mẻ nuôi cấy. Các loại bioreactor được sử dụng phổ biến là loại có thể tích 2 – 20 lít vì chúng có một số thuận lợi sau: dễ dàng vận hành, có thể vô ,trùng dễ dàng, giá thành thấp, kích thước nhỏ, tạo ra từ 100 – 10000 cây con trong một mẻ.
23 1.4.2.2. Phân loại bioreactor:
Có nhiều loại bioreactor được thiết kế nhằm nhiều mục đích khác nhau đối với từng loại cây trồng, kiểu nuôi cấy hay giai đoạn nuôi cấy.
Phân loại bioreactor theo ứng dụng:
Gồm 3 loại:
Bioreactor sử dụng để sản xuất sinh khối;
Bireactor sử dụng để sản xuất enzyme, hoạt chất thứ cấp;
Bioreactor sử dụng để chuyển hóa các hợp chất ngoại sinh theo các con đường chuyển hóa sinh học.
Phân loại theo chức năng hoạt động:
Gồm 2 loại:
Loại nuôi cấy ngập chìm cục bộ hay tạm thời.
Loại nuôi cấy ngập chìm toàn bộ hay liên tục: được dùng trong vi nhân giống có mật độ mẫu cấy cao khi mà sự ngập chìm không ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bình thường của mẫu cấy. Chẳng hạn khi nuôi cấy protocorm – like body, mô sẹo tạo phôi, phôi soma, cụm mô phân sinh và các chồi mắt. Nuôi cấy ngập chìm hoàn toàn cũng thích hợp cho nuôi cấy các thân hành và thân củ (Takayama, 1991).
Phân loại theo sự di chuyển của mẫu nuôi cấy:
Gồm 3 loại:
Mẫu nổi ngay sát bề mặt môi trường.
Mẫu lơ lửng trong môi trường.
Mẫu chìm ở đáy bioreactor.
Trong 3 loại trên, kiểu có mẫu nổi và chìm cho thấy sự phát triển rất tốt. Còn trong trường hợp mẫu lơ lửng, di chuyển trong môi trường dễ bị tổn thương hư hại nghiêm trọng. Nguyên nhân là do khi di chuyển chúng đã va chạm vào nhau, cái này đè lên cái kia dẫn đến stress (tổn thương) tế bào, kết quả là tăng trưởng bị suy giảm.
24
Phân loại theo hình thức khuấy:
Gồm 3 loại:
Bioreator khuấy máy.
Bioreator khuấy hơi nước.
Bioreator không khuấy.
Ngoài ra, có một loại bioreator cung cấp oxy mà không tạo bọt khí bằng cách dùng các ống silicone. Chúng được xem là rất phù hợp với nuôi cấy huyền phù tế bào phát sinh phôi. Và gần đây, có một loại bioreator acoustoc mist rất hiệu quả trong việc tăng sinh khối của rễ bất định (hairy root) (Ziv, 1999).
1.4.3. Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy lắc và bioreactor:
Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy lắc và bằng bioreator gồm các bước sau:
Bước I: Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng.
Bước II: Gồm 3 bước nhỏ (a) cảm ứng việc tạo nhiều chồi trên một diện tích bề mặt mẫu mô cấy (nuôi cấy trên môi trường agar); (b) tăng cường sự phát triển của các chồi bằng nuôi cấy lắc; (c) tăng cường sự phát triển của các chồi bằng kỹ thuật sử dụng tăng cường sự phát triển các chồi bằng kỹ thuật sử dụng bioreator.
Bước III: Giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con trước khi đem ra vườn ươm.
Trong đó, bước I là bước cơ bản cho mọi quá trình nuôi cấy nhằm hạn chế việc nhiễm khuẩn cho mẫu. Bước II là bước cảm ứng tạo nhiều chồi bên và chồi bất định trên mẫu mô nuôi cấy bằng cách cho thêm cytokinin vào môi trường. Kích thước của các chồi tạo ra quá nhỏ nên không thể chuyển sang bước II b (nuôi cấy lắc) hoặc bước II c (nuôi cấy bằng bioreactor). Mục đích của bước II b và II c là giúp cho các chồi phát triển, tăng trưởng nhanh hơn để tạo thành cây con (plantlets). Bước III là bước giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con, đây là bước cần thiết, tuy nhiên không phải áp dụng cho tất cả các loài; ở một số loài có thể bỏ qua bước này.
Quá trình nhân giống cho hệ thống nuôi cấy bioreator như sau: thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng cho mẫu mô hay đỉnh sinh trưởng, sau đó chuyển vào môi
25
trường có nồng độ cytokinin cao để kích thích hình thành cụm chồi. Mẫu mô mang cụm chồi sau đó được nhân nhanh bằng cách cấy chuyền vào môi trường tương tự. Các cụm chồi này được sử dụng như những hạt nuôi cấy trong bioreactor nhỏ để tạo ra cây con. Điều kiện nuôi cấy tối ưu được khảo sát trong những bước này. Một khi môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đã được thiết lập thì các cụm chồi này sẽ được tăng sinh để tiến hành nuôi cấy trong các bioreator lớn. Cây con tạo ra sau đó được chuyển ra đất.
1.4.4. Sự phát triển thực vật trong bioreator:
1.4.4.1. Quá trình phát sinh phôi soma:
Việc sử dụng môi trường lỏng nuôi cấy tế bào soma để tạo phôi đã được đề cập từ những năm 1958 trên cây Cà Rốt do Steward cộng sự tiến hành. Tính toàn thế của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phôi đơn bội.
Quá trình phát sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường sử dụng 2,4 – D) và nước dừa ban đầu. Sau đó dùng nhiều cytokinin, myo – inositol và giảm lượng nitrogen.
Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì phải hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường. Sau đó, trình tự giống như quá trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diễn ra (Ammirato, 1985).
Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các quy trình nhân sinh khối, chúng có thể được phân tách, đưa vào và khuấy trộn bằng một hệ thống tự động, sau đó có thể được cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp với sự hỗ trợ của hệ thống máy móc (Sakamoto và cộng sự, 1995).
1.4.4.2. Quá trình phát sinh cơ quan:
Hiện nay, hầu hết các thực vật được nhân giống thương mại trên môi trường bán rắn đều thông qua con đường phát sinh cơ quan. Đây là một quy trình tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Vì vậy nếu chuyển sang tự động hóa bằng máy sẽ giảm bớt được các thao tác bằng tay và giảm được giá thành lao động. Một giải pháp đã được sử dụng để tự động hóa là dùng môi trường nuôi cấy lỏng trong bioreactor.
26
1.4.5. Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy lỏng:
Quá trình nhân nhanh trong bioreactor đều sử dụng môi trường lỏng thay cho môi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Môi trường nuôi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification) (Debergh và cộng sự, 1992).
Cho đến nay, định nghĩa về hiện tượng thủy tinh thể vẫn chưa được rõ ràng. Nói chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý của thực vật trong quá trình tăng trưởng in – vitro, kết quả làm mất đi khả năng phát triển bình thường, và sau đó kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm.
Biểu hiện của thực vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng là thường yếu ớt, xuất hiện các tinh thể nước giống như thủy tinh, mọng nước ớ lá và ở chồi, hệ rễ phát triển kém. Lá là cơ quan chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong môi trường lỏng. Chúng phát triển một loại nhu mô vô tổ chức, loại này được tạo ra từ các lớp nhu mô xốp có không gian liên bào rộng, một loại mô mạch không định hình, một lớp biểu bì bất thường. Lớp mô biểu bì của các lá thừa nước thường phát triển không tốt và quá trình đóng mở khí khẩu không còn ổn định như trước.
Hậu quả của hiện tượng thủy tinh thể là lá ít phát triển trong điều kiện in – vitro cũng như ex – vitro và có thể cả cây cũng vậy, thường yếu và chết.
Do vậy, khi hiện tượng thủy tinh thể xảy ra thì chức năng quang hợp cũng như hô hấp của lá có thể không còn thực hiện được tốt như trước, nên cây sau khi chuyển ra đất thường ít khả năng sống sót và kém phát triển.
Sau khi nhân giống in – vitro, các cây xuất hiện hiện tượng bất thường về kiểu hình và cấu trúc giải phẫu, ở giai đoạn ex – vitro thường có hiện tượng bất thường về kiểu hình. Các biểu hiện sai hỏng, chẳng hạn như thừa nước, lá và chồi kém phát triển, phôi bất thường, rối loạn quá trình phát sinh phôi đều là kết quả của sự gián đoạn hay mất tín hiệu trong trình tự của quá trình tái tạo cơ quan ở thực vật. Các vấn đề nêu trên biểu hiện nghiêm trọng hơn đối với nuôi cấy lỏng và cần phải có những nghiên cứu sâu hơn để hiểu
27
rõ cũng như có thể kiểm soát được sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy bioreactor – một mô hình lớn của nuôi cấy lỏng.
Có nhiều nghiên cứu đã được báo cáo trong việc khắc phục hiện tượng thủy tinh thể và cũng thu được nhiều kết quả. Chẳng hạn như giảm độ ẩm tương đối bằng cách tạo sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài của bình nuôi cấy (Buddendorf và Woltering, 1995), tăng nồng độ agar trong môi trường nuôi cấy (Debergh và Harbaoui, 1981), sử dụng các chất hấp thụ ethylen như bột than hoạt tính (Mensuali và cộng sự, 1993), KMnO4 (Dimasi và cộng sự, 1993), hoặc alginate STS (Sarkar và cộng sự, 2002), sử dụng các loại bình nuôi cấy lớn hơn (Zobayed và cộng sự, 2001) hay bổ sung các chất chống thủy tinh thể (antihyperhydricity) có bán trên thị trường, tên thương mại là EM2 (A0807, Siagma – Aldrich, Pool, Dorset, UK), M – gel (Migros, Immensee, Switzerland), iota – type carrageenan (C1006, batch no 29225, Duchefa Biochemie BV, Haarlem, the Netherlands) (Adam và cộng sự, 2002).
1.4.6. Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy bằng bioreactor:
1.4.6.1. Thuận lợi
Nuôi cấy được các mẫu ngập chìm và phân bố theo không gian ba chiều nên tiết kiệm được không gian; tăng cường được sự thoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh; khi nuôi cấy ngập chìm và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau.
Theo Takayama và Akira (1994), một số thuận lợi chính của bioreactor trong vi nhân giống thực vật đó là: sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường; không có sự hạn chế về trao đổi khí, có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường, tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền; dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối; dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy; tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng hơn nếu được tăng cường không khí; mẫu cấy tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh; nhờ việc
28
liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả tạo được nhiều chồi hơn.
1.4.6.2. Khó khăn:
Mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn nhưng bên cạnh đó nó vẫn còn có những hạn chế nhất định. Chẳng hạn như theo Ziv (1999); tùy vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khác nhau; thường gặp hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào. Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.
Một vấn đề lớn nữa thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là việc nhiễm vi sinh vật. Nấm, vi khuẩn, nấm mốc và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các loại môi trường khác (rắn, bán rắn). Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương (Ziv, 1999).
Hình 1.6: Hai dạng bioreactor phổ biến
a) Bioreactor sục khí b) Bioreactor có cánh khuấy.
29