2.2.1. Phương pháp xác ựịnh VSV
Ớ Xác ựịnh tổng số VSV hiếu khắ: theo TCVN 5165-90. Ớ Xác ựịnh E.coli : theo TCVN 5155-90.
Ớ Xác ựịnh Clostridium perfringens: theo Quyết ựịnh 3348/2001/BD-BYT của Bộ Y tế.
Ớ Xác ựịnh Vibrio parahaemolyticus: theo Quyết ựịnh 3349/2001/Qđ-BYT của Bộ Y tế.
Ớ Xác ựịnh Salmonella: BS 5763-93
2.2.2. Phương pháp ựánh giá cảm quan
đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm theo phương pháp cho ựiểm theo TCVN 5090 Ờ 90. [16,17].
2.2.3. Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
Dung dịch Chitosan sử dụng trong nghiên cứu ựược pha với 3 nồng ựộ 1%; 1,5%; 2% trong acid acetic 1%. COS cũng ựược pha với 3 nồng ựộ 0,1% ; 0,2%; 0,3% nhưng trong môi trường nước. Cá sòng ựược mua từ cảng cá Cửa Bé, rửa sạch, ướp ựá, vận chuyển về phòng thắ nghiệm và sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu theo các bước tiến hành sau:
- Cá sòng nguyên liệu ựược chia thành các mẫu, mỗi mẫu 3 con. Mẫu ban ựầu (Mbự) là mẫu cá nguyên liệu chưa nhúng vào các dung dịch chitosan và COS. Các mẫu ban ựầu cũng ựược ựánh giá cảm quan và kiểm nghiệm các chỉ tiêu về vi sinh bao gồm: (tổng số VSV hiếu khắ, E.coli, S. aureus, Salmonella, Cperfringens, V.parahaemolyticus) ngay trước khi bắt ựầu tiến hành nghiên cứu.
- Cá sòng bảo quản bằng cách nhúng từng mẫu cá nguyên liệu ban ựầu vào dung dịch chitosan ở các nồng ựộ (1%, 1,5%, 2%) và COS với các nồng ựộ (0,1%, 0,2%, 0,3%). Sau khi nhúng vào chất bảo quản, cá ựược bảo quản bằng nước ựá ở nhiệt ựộ 0-3oC trong 48 giờ, sau các khoản thời gian bảo quản 0giờ, 24giờ và 48giờ bảo quản lấy mẫu ựánh giá cảm quan và kiểm nghiệm các chỉ tiêu về vi sinh: tổng số VSV hiếu khắ, E.coli, S.aureus, Salmonella, C.perfringens, V.parahaemolyticus) ựể ựánh giá khả năng ức khuẩn của các chất sử dụng.
Quá trình bố trắ thắ nghiệm tiến hành như sau:
Hình 2.2: Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm bảo quản cá sòng bằng nước ựá kết hợp với nhúng dung dịch chitosan và COS
Cá sòng tươi
Rửa sạch
Bảo quản bằng nước ựá
Chitosan nồng ựộ 1%;1,5%;2% trong a.acetic 1% hoặc COS
nồng ựộ 0,1%;0,2%;0,3% Msn M24 giờ M48giờ Mbự Phân tắch Cảm quan Vi sinh Ớ TSVKHK Ớ E.coli Ớ S. aureus Ớ C.perfringens Ớ Salmonella Ớ V.parahaemolyti cus Phân tắch và chọn nồng ựộ chất bảo quản thắch hợp
đề xuất công nghệ bảo quản Ớ Da
Ớ Mắt Ớ Cơ thịt Ớ Mùi
2.3. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU * Thiết bị: * Thiết bị:
Sử dụng các thiết bị hiện có trong phòng thắ nghiệm như: Tủ cấy AURA VF48 - Hãng Bioair - Ý, Tủ sấy UNE500 - Hãng Memmert - đức, Cân phân tắch Model AFA 210 LC - Hãng Adam - Anh độ chắnh xác: 0,1g, Máy dập mẫu Stomacher400 - Hãng Seward - đức, Máy ựếm khuẩn lạc Model SC6 - Bibby Ờ Anh, Nồi hấp vô trùng Model KT-30L, KT - 30LD - Hãng ALP- Nhật.
* Hóa chất:
Các hóa chất sử dụng trong ựề tài ựều là các hóa chất tinh khiết của Merck - đức.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Xử dụng phần mềm Excel ựể xử lý số liệu.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC đỊNH NỒNG đỘ CHITOSAN TRONG ACID ACETIC 1% THÍCH HỢP đỂ TIÊU DIỆT MỘT SỐ LOẠI VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ SÒNG HỢP đỂ TIÊU DIỆT MỘT SỐ LOẠI VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ SÒNG
BẢO QUẢN LẠNH BẰNG NƯỚC đÁ
3.1.1. Ảnh hưởng của Chitosan 1% trong acid acetic 1% ựến VSV tổng số trong quá trình bảo quản cá sòng trong nước ựá (1-3oC)
Thực hiện nghiên cứu theo sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm Hình 2.2 thu ựược kết quả ảnh hưởng của Chitosan 1%trong acid acetic 1% ựến TPC (tổng VSV hiếu khắ) trên cá sòng bảo quản bằng nước ựá như biểu ựồ hình 3.1.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Mbự Msn 24h 48h Các mẫu thắ nghiệm T P C (l o g X /m l)
mẫu ựối chứng chitosan 1% Mbự: Mẫu ban ựầu Msn: Mẫu sau nhúng
Hình 3.1: Tổng số VSV hiếu khắ khi bảo quản bằng Chitosan 1% trong acid acetic 1%
Từ kết quả nghiên cứu hình 3.1 cho thấy: số lượng VSV tổng số giảm dần theo thời gian bảo quản bằng nước ựá, sau 48 giờ bảo quản VSV giảm một cách ựáng kể ở mẫu xử lý bằng Chitosan 1% trong acid acetic 1%. Kết quả thực nghiệm thu ựược: mẫu ban ựầu (Mbự) có số lượng TPC là 1,92.104 CFU/g. Mẫu sau nhúng Chitosan 1% chưa bảo quản (0h bảo quản) (Msn) có số lượng TPC là 1,7.104 CFU/g, so với Mbự số lượng VSV giảm 11,46% TPC. Như vậy Chitosan
ngay sau khi nhúng ựã bám trên bề mặt cá và có tác dụng làm giảm VSV khá nhanh.
Mẫu nhúng Chitosan 1% bảo quản bằng nước ựá 24 giờ có số lượng TPC là 1,20.104 CFU/g so với Mbự giảm 37,50% TPC. Mẫu nhúng Chitosan 1% bảo quản bằng nước ựá 48 giờ có số lượng TPC là 0,56.104 CFU/g, giảm 70,83% TPC so với Mbự
Như vậy, thời gian bảo quản bằng Chitosan trong acid acetic 1% tăng thì TPC giảm ựáng kể, từ 37,50% ở 24h ựến 70,83% ở 48h. điều này ựược giải thắch là Chitosan là một polymer có hoạt tắnh sinh học cao, nó có tác dụng làm giảm VSV ở phạm vi rất rộng từ các vi khuẩn nấm men, nấm mốc ựến các VSV gây bệnh. Giả thuyết cho rằng khả năng ức chế VSV của chitosan là do làm thay ựổi tắnh thấm màng tế bào bằng sự tương tác giữa ựiện tắch (+) của chitosan và ựiện tắch (-) trên màng tế bào dẫn ựến chênh lệch áp suất kìm hãm sự phát triển hoặc VSV.
Một giả thuyết khác lại cho rằng, cơ chế kháng VSV của Chitosan là do sự tương tác của sản phẩm phân hủy với DNA của tế bào VSV, nó hạn chế quá trình tổng hợp mRNA và protein của tế bào VSV. Ngoài ra, chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của VSV do chúng lấy ựi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ bằng cách các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với nhóm anion của bề mặt thành tế bào. Vì vậy VSV sẽ bị ức chế vì mất cân bằng liên quan ựến các ion quan trọng.
Ngoài ra Cuero và cộng sự (1991) cũng cho rằng, nhờ tác dụng của nhóm NH3+ của Chitosan lên vị trắ mang ựiện tắch âm trên màng tế bào VSV dẫn ựến quá trình trao ựổi chất trên màng tế bào bị rối loạn, VSV không thể nhận chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển bình thường từ bên ngoài vào. Cuối cùng VSV sẽ chết.
Như vậy Chitosan 1% trong acid acetic 1% ựã ảnh hưởng ựáng kể ựến VSV tổng số trên cá sòng theo thời gian bảo quản. Tỷ lệ giảm VSV cũng tăng dần
so với thời gian. Lúc 0 giờ sau nhúng lượng VSV giảm là 11,46%; 24 giờ giảm 37,50% và 48 giờ thì giảm 70,83% so với lượng VSV ban ựầu có trên cá sòng.
3.1.2. Ảnh hưởng của Chitosan 1% trong acid acetic 1% ựến chất lượng cảm quan trong quá trình bảo quản cá sòng trong nước ựá (1-3oC):
0 5 10 15 20 25 Mbự 24h 48h Các mẫu thắ nghiệm đ iể m c ả m q u a n c h u n g
Mẫu bảo quản bằng Chitosan 1% Mẫu ựối chứng Mbự: Mẫu ban ựầu
Hình 3.2: điểm cảm quan khi bảo quản cá sòng bằng Chitosan 1% trong acid acetic 1%
Qua hình 3.2 ta có thể thấy ựược mẫu cá sòng khi ựã nhúng vào Chitosan 1% trong acid acetic 1% cá có chất lượng cảm quan tốt hơn mẫu ựối chứng sau khi bảo quản thời gian 24h và 48h. Kết quả cho thấy: mẫu ban ựầu có ựiểm cảm quan là 19,7. Sau 24h bảo quản bằng nước ựá, mẫu cá sòng ựược nhúng vào chitosan 1% rồi bảo quản trong nước ựá có ựiểm cảm quan là 18,7. Trong khi ựó mẫu ựối chứng chỉ bảo quản nước ựá có ựiểm cảm quan là 17,36. Sau 48h bảo quản bằng nước ựá, mẫu cá sòng ựược nhúng vào chitosan 1% trong acid acetic 1% rồi bảo quản trong nước ựá có ựiểm cảm quan là 16,8. Trong khi ựó mẫu ựối chứng chỉ bảo quản nước ựá có ựiểm cảm quan là 13,42.
Nhìn chung chất lượng cảm quan của các mẫu ựều giảm theo thời gian, nhưng mẫu xử lý bằng chitosan 1% cho chất lượng tốt hơn với mẫu không bảo quản.
3.1.3. Ảnh hưởng của Chitosan 1,5% trong acid acetic 1% ựến VSV tổng số trong quá trình bảo quản cá sòng trong nước ựá (1-3oC):
Thực hiện nghiên cứu theo sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm Hình 2.2 thu ựược kết quả ảnh hưởng của Chitosan 1,5% trong acid acetic 1% ựến TPC (tổng VSV hiếu khắ) trên cá sòng bảo quản bằng nước ựá như biểu ựồ hình 3.3
0 2 4 6 8 Mbự Msn 24h 48h Các mẫu thắ nghiệm T P C (l o g X /m l)
mẫu ựối chứng chitosan 1,5%
Mbự: Mẫu ban ựầu Msn: Mẫu sau nhúng
Hình 3.3: Tổng số VSV hiếu khắ khi bảo quản bằng Chitosan 1,5% trong acid acetic 1%
Từ kết quả nghiên cứu hình 3.3 cho thấy: Số lượng VSV tổng số giảm dần theo thời gian bảo quản bằng nước ựá, sau 48 giờ bảo quản VSV giảm một cách ựáng kể ở mẫu xử lý bằng Chitosan 1,5% trong acid acetic 1%. Kết quả thực nghiệm: Mẫu ban ựầu (Mbự) có số lượng TPC là 2,05.104 CFU/g. Mẫu sau nhúng Chitosan 1,5% chưa bảo quản (0h bảo quản) (Msn) có số lượng TPC là 1,56.104 CFU/g, so với Mbự số lượng VSV giảm 23,90% TPC. Như vậy Chitosan ngay sau khi nhúng ựã bám trên bề mặt cá và có tác dụng làm giảm VSV khá nhanh. Mẫu nhúng Chitosan 1,5% trong acid acetic 1% bảo quản bằng nước ựá 24 giờ có số lượng TPC là 1,05.104 CFU/g so với Mbự giảm 48,78% TPC. Mẫu nhúng Chitosan 1,5% bảo quản bằng nước ựá 48 giờ có số lượng TPC là 0,03.104 CFU/g, giảm 98,54% TPC so với Mbự
Thời gian bảo quản bằng Chitosan tăng thì TPC giảm ựáng kể, từ 48,78% ở 24h ựến 98,54% ở 48h. Chitosan là một polymer có hoạt tắnh sinh học cao, nó có tác dụng ức chế VSV ở phạm vi rất rộng từ các vi khuẩn nấm men, nấm mốc ựến các VSV gây bệnh (ựược giải thắch tương tự trang 35).
Như vậy, lượng VSV tổng số của mẫu bảo quản bằng chitosan 1,5% trong acid acetic 1% có giảm so với mẫu không ựược bảo quản. Phần trăm VSV giảm cũng tăng dần so với thời gian. Lúc 0h lượng VSV giảm là 23,90%; 24 giờ giảm 48,78% và 48 giờ thì giảm 98,54% so với lượng VSV ban ựầu có trên cá sòng. So với Chitosan 1% lúc 0h lượng VSV giảm ựối với là 11,46%; 24 giờ giảm 37,50% và 48 giờ thì giảm 70,83%. điều này chứng tỏ Chitosan nồng ựộ 1,5% bảo quản tốt hơn ở 1%.
3.1.4. Ảnh hưởng của Chitosan 1,5% trong acid acetic 1% ựến chất lượng cảm quan trong quá trình bảo quản cá sòng trong nước ựá (1-3oC):
0 5 10 15 20 25 Mbự 24h 48h Các mẫu thắ nghiệm đ iể m c ả m q u a n c h u n g
Mẫu bảo quản bằng Chitosan 1,5% Mẫu ựối chứng Mbự: Mẫu ban ựầu
Hình 3.4: điểm cảm quan khi bảo quản cá sòng bằng Chitosan 1,5% trong acid acetic 1%
Qua hình 3.4 ta có thể thấy ựược mẫu cá sòng khi ựã nhúng vào Chitosan 1,5% trong acid acetic 1% cá có chất lượng cảm quan tốt hơn mẫu ựối chứng sau khi bảo quản thời gian 24h và 48h. Qua kết quả cho thấy mẫu ban ựầu có ựiểm cảm quan là 19,7. Sau 24h bảo quản bằng nước ựá: Mẫu cá sòng ựược nhúng vào
chitosan 1,5% rồi bảo quản trong nước ựá có ựiểm cảm quan là 19,38. Trong khi ựó mẫu ựối chứng chỉ bảo quản nước ựá có ựiểm cảm quan là 17,36.
Sau 48h bảo quản bằng nước ựá: Mẫu cá sòng ựược nhúng vào chitosan 1,5% rồi bảo quản trong nước ựá có ựiểm cảm quan là 16,38. Trong khi ựó mẫu ựối chứng chỉ bảo quản nước ựá có ựiểm cảm quan là 13,42 .
Như vậy Chitosan 1,5% trong acid acetic 1% ựã không ảnh hưởng nhiều ựến chất lượng cá sòng trong quá trình bảo quản.
3.1.5. Ảnh hưởng của Chitosan 2% trong acid acetic 1% ựến VSV tổng số trong quá trình bảo quản cá sòng trong nước ựá (1-3oC):
0 2 4 6 8 Mbự Msn 24h 48h Các mẫu thắ nghiệm T P C (l o g X /m l)
mẫu ựối chứng chitosan 2% Mbự: Mẫu ban ựầu Msn: Mẫu sau nhúng
Hình 3.5: Tổng số VSV hiếu khắ khi bảo quản bằng Chitosan 2% trong acid acetic 1%
Từ kết quả nghiên cứu hình 3.5 cho thấy: Số lượng VSV tổng số giảm dần theo thời gian bảo quản bằng nước ựá, sau 48 giờ bảo quản VSV giảm một cách ựáng kể ở mẫu xử lý bằng Chitosan 2%. Kết quả thực nghiệm cho thấy, mẫu ban ựầu (Mbự) có số lượng TPC là 5,20.104 CFU/g. Mẫu sau nhúng Chitosan 2% chưa bảo quản (0h bảo quản) (Msn) có số lượng TPC là 4,50.104 CFU/g, so với Mbự số lượng VSV giảm 13,46% TPC. Như vậy Chitosan ngay sau khi nhúng ựã bám trên bề mặt cá và có tác dụng ức chế VSV khá nhanh. Mẫu nhúng Chitosan 2% trong acid acetic 1% bảo quản bằng nước ựá 24 giờ có số lượng TPC là 2,00.104 CFU/g
so với Mbự giảm 61,54% TPC. Mẫu nhúng Chitosan 2% bảo quản bằng nước ựá 48 giờ có số lượng TPC là 0,22.104 CFU/g, giảm 95,77% TPC so với Mbự
Như vậy: Thời gian bảo quản bằng Chitosan tăng thì TPC giảm ựáng kể, giảm từ 61,54% ở 24h ựến 95,77% ở 48h.
Lượng VSV tổng số của mẫu bảo quản bằng chitosan 2% trong acid acetic 1% có giảm so với mẫu không ựược bảo quản. Phần trăm VSV giảm cũng tăng dần so với thời gian. Lúc 0h lượng VSV giảm là 13,46%; 24 giờ giảm 61,54% và 48 giờ thì giảm 95,77% so với lượng VSV ban ựầu có trên cá sòng.So với phần trăm VSV giảm khi dùng chitosan 1,5% lúc 0h lượng VSV giảm là 23,90%; 24 giờ giảm 48,78% và 48 giờ thì giảm 98,54% so với lượng VSV ban ựầu có trên cá sòng. Nhìn chung lúc 0 giờ và lúc 48 giờ thì mẫu bảo quản bằng chitosan 2% lượng giảm VSV tổng số không bằng, nhưng sau 24 giờ thì lại khác khả năng kháng khuẩn của chitosan 2% mạnh mẽ nhất (61,54% lớn hơn 48,78%). Có nghĩa là trong quá trình bảo quản có thể lượng nước ựá tan ra làm trôi ựi lượng chitosan bám trên thân cá dẫn ựến cá không ựược bảo quản tốt. Tuy nhiên, qua thực nghiệm vẫn cho thấy Chitosan nồng ựộ càng cao khả năng kháng VSV tốt hơn
3.1.6. Ảnh hưởng của Chitosan 2% trong acid acetic 1% ựến chất lượng cảm quan trong quá trình bảo quản cá sòng trong nước ựá (1-3oC):
Qua hình 3.6 ta có thể thấy ựược mẫu cá sòng khi ựã nhúng vào Chitosan 2% trong acid acetic 1% cá có chất lượng cảm quan tốt hơn mẫu ựối chứng sau khi bảo quản thời gian 24h và 48h. Kết quả cho thấy, mẫu ban ựầu có ựiểm cảm quan là 19,7.
Sau 24h bảo quản bằng nước ựá, mẫu cá sòng nhúng chitosan 2% trong acid acetic 1% có ựiểm cảm quan là 19,55. Trong khi ựó mẫu ựối chứng chỉ bảo quản nước ựá có ựiểm cảm quan là 17,36.
Sau 48h bảo quản bằng nước ựá, mẫu cá sòng nhúng chitosan 2% trong acid acetic 1% có ựiểm cảm quan là 16,54. Trong khi ựó mẫu ựối chứng chỉ bảo quản nước ựá có ựiểm cảm quan là 13,42.
0 5 10 15 20 25 Mbự 24h 48h Các mẫu thắ nghiệm đ iể m c ả m q u a n c h u n g
Mẫu bảo quản bằng Chitosan 2% Mẫu ựối chứng Mbự: Mẫu ban ựầu
Hình 3.6: Cảm quan khi bảo quản cá sòng bằng Chitosan 2% trong acid acetic 1%
Như vậy, bảo quản cá sòng bằng Chitosan 2% trong acid acetic 1% ựạt chất lượng cảm quan tốt hơn hẳn so mẫu không bảo quản và các mẫu bảo quản ở nồng ựộ thấp hơn. điều này chứng tỏ Chitosan 2% ựã ức chế sự phát triển của VSV gây thối và ựã giữ ựược ựộ tươi của cá sòng.
3.1.7. Ảnh hưởng của Chitosan trong acid acetic 1% ựến sự biến ựổi
Staphylococcus aureus trong bảo quản cá sòng ở nhiệt ựộ từ 1-3oC:
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của Chitosan trong acid acetic 1% ựến Staphylococcus