2.1. Đối tƣợng
* Đối tƣợng nghiên cứu gồm 2293 bệnh nhân bị bệnh máu tuổi từ 07 đến 91 đƣợc vào viện điều trị tại các khoa Bệnh máu, Viện Huyết học - truyền máu TW từ tháng 12/2009 đến tháng 04/2011.
* Các bệnh nhân trên bao gồm: 1442 BN Lơ xê mi (LXM), 189 BN Thalassaemia, 172 BN U Lympho không Hodgkin (U lympho), 73 BN Đa u tủy xương (ĐUTX), 60 BN Rối loạn sinh tủy (RLST), 53 BN Tăng tiểu cầu tiên phát (TTCTP) và 304 BN bị các bệnh máu khác.
2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Bệnh phẩm xét nghiệm
- 5 ml máu không chống đông và 2 ml máu chống đông của các BN trên.
2.2.2. Dụng cụ - Pipetman.
- Lọ đựng sinh phẩm.
- Giá đựng gelcard.
- Giấy in mã vạch.
2.2.3. Máy móc
- Máy tự động Hemos SP II.
- Máy đọc kết quả gelcard Scangel Reader.
- Máy ủ gelcard.
- Máy li tâm gelcard.
- Máy li tâm ống thẳng.
- Tủ lạnh.
Hình 2.1. Máy tự động Hemos SP II 2.2.4. Sinh phẩm, hóa chất
- Panel hồng cầu sàng lọc KTBT do viện Huyết học - truyền máu TW sản xuất gồm kháng nguyên của các hệ nhóm máu Rh, Kell, Duffy, Kid, Lutheran, MNSs, P, Mia, Lewis.
- Tấm gelcard Scangel Coombs Anti - IgG của hãng Biorad.
- Các kháng huyết thanh chuẩn (Anti D, Anti C, Anti c, Anti E…) - Dung dịch Scanliss.
- Nước cất.
- Dung dịch rửa Decon 0,03%.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang, kết hợp cả hồi cứu và tiến cứu.
2.3.1. Tiêu chẩn chọn bệnh nhân
- Bệnh nhân có chỉ định làm xét nghiệm sàng lọc KTBT.
- Loại trừ những bệnh nhân có: Bệnh tự miễn, bệnh nhân Thalassaemia có KTBT có kết quả nghiệm pháp Coombs trực tiếp dương tính.
- Thu thập các số liệu của bệnh nhân về: Giới tính, tuổi, chẩn đoán lâm sàng, nhóm máu, số lần truyền máu (Khối hồng cầu).
2.3.2. Kỹ thuật áp dụng
Kỹ thuật đƣợc sử dụng để sàng lọc KTBT trong nghiên cứu này là kỹ thuật gelcard trên hệ thống máy tự động Hemos SP II.
* Nguyên lý của kỹ thuật: Nguyên lý của kỹ thuật là phản ứng ngƣng kết. Trong mỗi cột gel trên tấm gelcard có buồng phản ứng, có sẵn thuốc thử kháng globulin người và có các hạt gel làm màng ngăn giữ đám ngưng kết.
Sau khi ly tâm cột gel, nếu có phản ứng kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu xảy ra, các đám ngƣng kết sẽ đƣợc giữ lại trên bề mặt của cột gel và không còn hồng cầu tự do để lọt qua kẽ các hạt gel đi xuống đáy cột gel (phản ứng dương tính 4+), mức độ ngưng kết tùy thuộc vào sự phân bố của đám ngưng kết trên cột gel. Nếu không có phản ứng kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu xảy ra, các hồng cầu sẽ lọt qua kẽ các hạt gel để đi xuống đáy cột gel (phản ứng âm tính) [9].
* Đánh giá các mức độ ngưng kết sau khi ly tâm cột gel
- Ngƣng kết 4+: Ngƣng kết là một đám lớn tập trung trên bề mặt của cột gel, không có hồng cầu tự do ở đáy cột gel.
- Ngƣng kết 3+: Các đám ngƣng kết tập trung ở 1/3 trên của cột gel, rất ít hồng cầu tự do ở đáy cột gel.
- Ngƣng kết 2+: Các đám ngƣng kết trải theo chiều dài 1/2 trên của cột gel, có khá nhiều hồng cầu tự do ở đáy cột gel.
- Ngƣng kết 1+: Các đám hồng cầu ngƣng kết tập trung chủ yếu ở 1/3 dưới của cột gel, nhiều hồng cầu tự do ở đáy cột gel.
- Không ngƣng kết (Âm tính): Hồng cầu tự do lắng hết xuống đáy cột gel.
Hình 2.2. Các mức độ ngưng kết trên gelcard
* Tiến hành kỹ thuật:
Bước 1: Chuẩn bị máy
- Pha dung dịch rửa máy Decon 0,03%.
- Thay bình nước thải.
- Chuẩn bị nước cất.
- Bật máy Hemos SP II và hệ thống máy tính đi kèm.
- Chạy chương trình điều khiển.
- Thực hiện tráng rửa máy theo quy trình đã định.
Bước 2: Chuẩn bị panel hồng cầu sàng lọc
- Pha 3 khối hồng cầu sàng lọc O1, O2, O3 đã được sản xuất trước đó thành dung dịch hồng cầu 1% trong dung dịch Scanliss chứa trong 3 lọ thủy tinh đã dán sẵn nhãn.
- Xếp lọ thuốc thử panel hồng cầu sàng lọc vào vị trí máy quy định.
Bước 3: Chuẩn bị mẫu
- Ly tâm tách huyết thanh ống máu của bệnh nhân 2000 vòng/ phút x 3phút.
- Dán mã vạch lên thành ống nghiệm.
- Xếp các ống máu vào giá theo quy định của máy.
- Mở lớp giấy nhôm bảo vệ và xếp các tấm gelcard vào vị trí quy định.
Bước 4: Chạy máy
- Chọn chế độ thực hiện sàng lọc KTBT trong điều kiện AHG.
- Thực hiện theo các bước của chương trình.
Bước 5: Ủ các gelcard trên ở 370C/ 15 phút bằng máy ủ chuyên dụng.
Bước 6: Ly tâm gelcard 9000 vòng phút x 10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng.
Bước 7: Đọc kết quả bằng máy đọc, xác nhận, sau đó lưu kết quả vào máy và sổ theo dõi kết quả sàng lọc KTBT.
Bước 8: Tráng rửa máy theo quy trình và tắt máy.
2.3.3. Mô hình nghiên cứu
2.4. Xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và EPI 6.
Mẫu máu không chống đông của bệnh nhân
Bảo quản
quầy lạnh Tách huyết thanh
Mục tiêu 1: Nghiên cứu tỷ lệ KTBT và một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ xuất hiện KTBT ở BN bị bệnh máu tại Viện Huyết học - truyền máu TW từ tháng 12/2009 - 04/2011
Mục tiêu 2: Nhận xét ưu, nhược điểm của máy tự động Hemos SP II trong xét nghiệm sàng lọc KTBT.
Định danh KTBT Âm tính Dương tính
Truyền máu cho bệnh nhân
Sàng lọc KTBT bằng kỹ thuật gelcard trên hệ thống máy Hemos SP II
CHƯƠNG 3