Phơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu điều tra hộ gia đình 2.4.1.1. Phơng pháp lấy mẫu

- Phơng pháp lấy mẫu phân tầng có định hớng: Dựa vào danh sách các tỉnh trồng nhiều ngô nhất do Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông Thôn cung cấp, gồm Hà Giang, Sơn La, Lai Châu, Cao Bằng, bốc thăm ngẫu nhiên, chọn Hà Giang làm địa điểm nghiên cứu. Tại Hà Giang, dựa vào danh sách các huyện, bốc thăm ngẫu nhiện chọn huyện Quảng Bạ. Dựa danh sách các xã của Quảng Bạ, bố thăm ngẫu nhiên chọn xã Cán Tỷ.c

- Chọn hộ gia đình điều tra phỏng vấn: dựa vào danh sách các hộ do Uỷ ban xã cung cấp, và dựa vào bảng số ngẫu nhiên, chọn đủ số hộ cần nghiên cứu [17] [19].

2.4.1.2. Cì mÉu.

Cỡ mẫu Phỏng vấn hộ gia đình: đợc tính theo công thức [17] [19].

Z2 -(1 α/2)x p x (1 p)- n =

e 2

Trong đó: n: số hộ gia đình cần điều tra

Z (1-α/2) = 1,96 (hệ số tin cậy ở mức xác xuất 0,05) p: tỷ lệ ớc đoán hộ gia đình có kiến thức VSATTP = 0,5 e: độ chính xác mong muốn = 0,078

thay vào công thức, tính đợc số hộ (n) = 158 (làm tròn là 160 hộ) 2.4.1.3. Phơng pháp điều tra

- Tại thực địa: Phỏng vấn ngời dân bằng mẫu phiếu điều tra thiết kế sẵn (phụ lục , đề nghị ngời dân trả lời một số câu hỏi theo mẫu phiếu điều 2) tra, cán bộ điều tra điền vào mẫu để tìm hiểu nguyên nhân gây ô nhiễm Ochratoxin trong ngô liên quan đến cơ cấu sản xuất, thu hoạch, bảo quản và sử dụng ngô. Cán bộ đi phỏng vấn là cán bộ y tế cấp xã, cấp huyện, cấp tỉnh, trớc khi đi phỏng vấn đợc tập huấn cẩn thận về cách thu thập thông tin trong phiÕu ®iÒu tra.

- Điều tra hồi cứu kết hợp điều tra cắt ngang số lợng ngời bị bệnh ung th và bệnh viêm thận mãn tại xã điều tra của huyện Quản Bạ. Nguồn số liệu thu thập từ Trạm y tế xã, Trung tâm Y tế huyện, Bệnh viện tỉnh Hà Giang.

Tìm mối liên quan giữa số lợng bệnh nhân của các vùng có mức tiêu thụ ngô

khác nhau, (phụ lục 3) Thống kê Y tế thực hiện ở tất cả các tuyến của địa . phơng, vì vậy để tránh trùng lặp nhóm nghiên cứu đã loại các hồ sơ của các bệnh nhân theo nguyên tắc chỉ tính một lần duy nhất ở tuyến cao nhất, nếu các

tuyến dới cũng có hồ sơ của bệnh nhân đó thì loại khỏi danh sách thống kê.

Không tính nhiều lần cho một bệnh nhân.

2 2.4. . Phân tích mẫu ngô

2.4.2.1. Số lợng mẫu: Do kinh phí có hạn nên chỉ hạn chế số lợng mẫu phân tích đánh giá mức độ ô nhiễm 63 mẫu ngô đợclà lấyngẫu nhiên tại các hộ gia đình. Mẫu đ c lợ ấy vào một vụ. Xác định hàm lợng Ochratoxin A trong ngô bằng phơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), kỹ thuật chiết xuất theo phơng pháp của AOAC 1990 [24], [29].

2.4.2. 2. Phơng pháp phân tích mẫu

- Hoá ch t: Tất ả hoá hất (chlorua kali, acid chlohydric, a idấ c c c pho h isp or c,…) ở mức PA. Tất c ả dung môi (methanol, chlorof rm, o acetonitrile, propanol-2-ol, -n hexane) ở mức HPLC.  N ớ c khử ion đợc sử dụng để chuẩn ị các b dung dịch dùng trong quá trình tách chiết, tinh chế và phân tích trên HPLC.

- Chuẩn bị các dung ch hudị c ẩn: Các dung dịch huẩn ợc huẩn bị c đ c 10 mg OTA/ml methanol. Một loạt các dung dịch huẩn từ c 0,3 đến 100 ng OTA/ml đợc chuẩn bị bằng pha loãng. ồng N độ ủa c dung dịch chuẩn gốc

đợc xác định bằng đ ấộ h p phụ tia c c ự tím (A) theo công thứ :c

ρ(àg/ml) = 1000maA ε

Trong đó : ρ nồng đ cộ ủa độc tố chu n trong d ng dẩ u ịch.

ma trọng lợn pg hân tử

ε khả năng ấp thu của phh ân tử tại λmax

λmax bớc sóng ấp thu ch ực đ ại

Độ tc ố ma (g/mol) Dung môi λmax ε m(c 2mol-1)

Ochratoxin A 403 Methanol 333 5440

- Định lợng OTA trên HPLC:

Sử dụng thiết bị HPLC của Nhật

Để tối u hoá độ nhạy cả m khi phân tích OTA sử dụng c c á thông số hu nh quaỳ ng kích thích và phát xạ khác nhau (OTA 335 và 465 nm ) Phân . tích đợc tiến ành trên ộth c C18 (3àm C18, 0,46 x 25 cm).

Hệ thống đợc ph n â tích ớv i phase động H3PO4 (0,33 M)/

acetonitrile/ prop noa l-2 (650/ 00/50 ; tốc độ dò4 ) ng 0,5 ml/ phút. Thời gian

đối với OTA là 56 phút. Cá sắ ký ồ ợ phân c c đ đ c tích dựa vào phần mềm Class L- C10 của Shimadzu versi n 1.60. o

+ Ch ết uất: Thêmi x 10 ml dung chdị KCl 4% (pH 1,5) vào 20 m g ẫu

đã đợc nghiền nhỏ. Rồi đợc thêm vào 90 ml acetonitrile, lắc 20 phút.

Chất hiết c đợc lọcqua giấ ylọc nhờ út chân kh ng.h ô

+ Tinh chế: 1 00 ml -n h aex ne đợc thêm vào dịch c lọ , lắc 5 phút, sau khi để ắng, bỏ lớp trên, l lặp lại bớc này 1 lần nữa. Thêm vào ớ l p dới 50 ml nớc khử ion, và 100 ml chloroform. Lớp ung md ôi trên đợc chiết lại 2 lần với 50 ml chloroform. T n chung chlrộ oroform chiết đợc.

Cho bay hơi trong cô quay cho đến khi gần khô ở 400C, tránh

ánh sáng. Bình chứa chlorof rm đợc o tr ng á rửa bằng choloroform chuyển sang ống nghiệm và m khô là d iớ khí nit . 2ml ơ methanol đợc thêm vào,

đánh siêu âm, lọc qua giấy lọc có kích thớc lỗ lọc nhỏ hơn 0,45àm. Làm khô d iớ khí nit 500 ơ. àl methanol đợc thêm vào và đem phân tích trên HPLC (phô lôc 1).