Trong nghiên cứu của Ray Butler và cộng sự, đã thử nghiệm theo 2 phương pháp là dùng dung dịch lắng của trầm tích cho tiếp xúc với phôi trong 24 giờ và dùng hoàn toàn trầm tích cho tiếp xúc với phôi trong 24 giờ và 48 giờ (Bảng 1.9).
Điểm kết thúc của tất cả các thử nghiệm là khả năng của phôi hàu phát triển bình thường đến giai đoạn ấu trùng hình chữ D trong vòng 24 hoặc 48 giờ [102]. Tuy nhiên, các nghiên cứu trầm tích được thêm chuẩn kim loại nặng, cụ thể là Cu2+ và Pb2+ lên quá trình thụ tinh và phát triển của phôi, ấu trùng hàu còn rất hạn chế và ở
Việt Nam hầu như chưa có, mặc dù, phát triển nuôi hàu Thái Bình dương rất mạnh trong những năm qua, đặc biệt vùng cửa sông Sài Gòn – Đồng Nai.
Quy trình thử nghiệm sự thụ tinh của hàu (Crassostrea gigas) 1.3.5.1
Mô hình thí nghiệm là mô phỏng từ nghiên cứu của Mai và cộng sự để xác định độc tính Cu lên thụ tinh hàu [65] và quá trình thử nghiệm độc tính dung dịch rửa giải từ trầm tích [109,93,111]. Trong giai đoạn 2 giờ, trứng phải trải qua giai đoạn đầu của sự phân cắt và thường đạt đến giai đoạn 16-32 tế bào (Bảng 1.10 và Hình 1.1) [105]. Sau 2 giờ, phôi hàu phải được xác định bằng kính hiển vi.
Hình 1.1 Quá trình phát triển của phôi hàu Crassostrea gigas Nguồn: [105]
Chú thích:
2A: Trứng chưa qua xử lý (sau khoảng 30 phút trong nước biển) 2B: Trứng thụ tinh cho thấy phân cực;
2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I: Trứng thụ tinh trải qua quá trình phân chia tế bào.
Bảng 1.10 Phát triển phôi hàu Crassostrea gigas bình thường Giai đoạn Dạng tế bào Số lượng tế bào
1 Đối xứng 2
2 Dạn chân mèo 4
3 Gần với hình cầu 8
4 Gần với hình cầu 6
5 Có màu tím đen 32
Nguồn: [105]
Quy trình thử nghiệm sự phát triển của ấu trùng hàu (Crassostrea gigas) 1.3.5.2
Qui trình được mô tả cho tiến hành thử nghiệm độc tính của các mẫu dung dịch rửa giải lên sự phát triển của ấu trùng của hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) [106]. Trong thử nghiệm, phôi hàu được tiếp xúc với các mẫu dung dịch rửa giải với một loạt các nồng độ khác nhau trong khoảng thời gian 24 giờ. Khi đó, phát triển bình thường mô tả sự chuyển đổi của phôi trong khoảng thời gian 24 giờ là ấu trùng “hình chữ D”, nơi ghép nối khớp vỏ có thể nhìn thấy. Mặc dù thời gian tiếp xúc ngắn, nhưng kích hoạt tế bào với cường độ cao sẽ làm suy giảm của một số quá trình sinh lý và sinh hóa quan trọng, có thể dẫn đến phát triển kém. Phát triển bất thường được đặc trưng bởi những phôi chết ở giai đoạn đầu hoặc ấu trùng phát triển nhưng không đạt đến giai đoạn hình chữ D. Điều này sẽ kéo dài từ không có các ảnh hưởng bất thường (ở nồng độ thử nghiệm thấp) với phát triển kém (ở nồng độ thử nghiệm cao hơn) trong tất cả các phôi và có thể chết (gây chết).
a. Phôi hàu (Crassostrea gigas) nên được tiếp xúc trong thời hạn 24 ± 2 giờ.
b. Số lượng phôi trong mỗi giếng thử nghiệm khi bắt đầu các thử nghiệm cần xấp xỉ 50-100 trên l mL.
c. Nhiệt độ của dung dịch pha loãng thử nghiệm cần có duy trì ở mức 24 ± 2oC trong suốt thời gian thử nghiệm.
d. Độ pH của dung dịch pha loãng thử nghiệm nên nằm trong khoảng 6,0-8,5 khi bắt đầu của thử nghiệm.
e. Lượng oxy hòa tan trong dung dịch pha loãng thử nghiệm khi bắt đầu các thử nghiệm cần được lớn hơn 60% ASV.
f. Độ mặn dung dịch thử nghiệm nên nằm trong khoảng 22-36 ‰.
g. Kết quả của các thử nghiệm độc tính phải được loại bỏ nếu tỷ lệ ấu trùng bất thường trong thí nghiệm kiểm soát lớn hơn 40%.
Phương pháp đánh giá theo EC50
1.3.5.3
EC50 là nồng độ độc tố gây ảnh hưởng 50% phôi không thụ tinh sau 2 giờ hay ấu trùng hàu tiếp xúc không phát triển thành ấu trùng hình chữ D bình thường sau 24 giờ.
Các thử nghiệm phát triển của ấu trùng nên được chấm dứt sau 24 ± 2 giờ. Dung dịch đệm formaldehyt nờn được thờm vào mỗi thử nghiệm (20 àl dung dịch đệm formaldehyt cho mỗi mL thử nghiệm pha loãng) để cố định và bảo quản các ấu trùng. Thao tác này cần được tiến hành trong tủ hút. Nước biển nhân tạo có thể có sử dụng như là một thay thế cho nước biển tự nhiên và được chuẩn bị bằng cách pha nước cất hoặc nước khử ion để có độ mặn 34‰ ± 2 với muối biển loại phân tích [106].
Nồng độ ảnh hưởng 50% của ấu trùng hàu tiếp xúc không phát triển thành ấu trùng hình chữ D bình thường sau 24 giờ. Các dữ liệu (phần trăm của ấu trùng hình chữ D bình thường và bất thường quan sát được) (Hình 1.2) được sử dụng để xác định nồng độ ảnh hưởng sự phát triển của ấu trùng.
Hình 1.2 Quá trình phát triển của ấu trùng sau 24 giờ
Nguồn: [105]
Chú thích: [105]
2J: Ấu trùng bình thường sau 24 giờ 2K: Ấu trùng bất thường sau 24 giờ
Đường cong phù hợp áp dụng để đánh giá là sử dụng các mô hình hồi quy. Mỗi mô hình đã thiết lập dữ liệu riêng. Mô hình Probit và Logit là những công cụ thống kê phổ biến nhất cho việc đánh giá điển hình đường cong hình chữ "S" về nồng độ và đáp ứng. Trong phương pháp Probit dữ liệu gốc được xử lý bằng cách chuyển đổi probit [112]. Một điều kiện tiên quyết quan trọng đối với thử nghiệm là thử nghiệm đối chứng phải có dưới 20 % cá thể thử nghiệm chết [113].
Giới thiệu về cửa sông Sài gòn - Đồng Nai 1.4