4.2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS CARE
4.2.1. Nghiên cứu quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care
4.2.1.1. Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể
Theo các nghiên cứu trước đây, virus Care có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt với các loài động vật: chó, thỏ và ngựa. Trong đó chó là động vật chủ gây bệnh của virus Care, nên huyết thanh thu từ chó để điều trị có tính cùng loài sẽ ít gây phản ứng cục bộ. Thỏ là loài động vật được chăn nuôi phổ biến, dễ nuôi, có thể triển khai nuôi số lượng lớn và huyết thanh có tính phản ứng khác loài thấp. Ngựa là động vật lớn có ưu điểm trong khai thác huyết thanh khi sản xuất quy mô lớn. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào hai đối tượng vật nuôi là chó và thỏ, vì đây là hai loài động vật dễ nuôi và dễ triển khai trong công tác nghiên cứu và sản xuất quy mô pilot. Chúng tôi đã tiêm virus nhược độc Care cho cả hai đối tượng động vật là chó và thỏ lần 1 (được tính là ngày 0). Sau đó 7 ngày chúng tôi lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể lần 1. Vào ngày 14, trước khi tiêm virus nhược độc mũi 2 chúng tôi đã lấy máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể lần 2. Ngày 28, chúng tôi lấy máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể lần 3 rồi tiêm virus nhược độc mũi 3. Ngày 42 và ngày 56 chúng tôi chỉ lấy máu để kiểm tra kháng thể lần 4 và lần 5. Qui trình tiêm được thể hiện tại sơ đồ Hình 4.5.
Hình 4.5. Sơ đồ tối mễn dịch cho động vật thí nghiệm để xác định loài động vật dùng sản xuất kháng thể Care
Động vật thí nghiệm (Thỏ, chó )
Tiêm virus nhược độc Care lần 1
Sau 7 ngày Sau 14 ngày
Kiểm tra hàm lượng kháng thể
Care lần 1
Kiểm tra hàm lượng kháng
thể lần 2
14 ngày sau tiêmlần 1
Tiêm virus nhược độc Care lần 2 Kiểm tra hàm
lượng kháng thể lần 3
Sau 28 ngày
Lần 3 Sau 42 ngày
Kiểm tra hàm lượng kháng thể lần 4
Sau 56 ngày
Kiểm tra hàm lượng Kháng thể
lần 5
Lựa chọn Động vật thí nghiệm
Sau khi tiêm động vật kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể được trình bày ở hình 4.6.
Hình 4.6. Hiệu giá kháng thể Care sau gây tối miễn dịch ở động vật thí nghiệm
Kết quả cho thấy: Khi gây miễn dịch với virus Care nhược độc cho chó và thỏ, cả hai loài đều đáp ứng tốt với kháng nguyên, động vật thí nghiệm phát triển khỏe mạnh bình thường, không có phản ứng phụ. Theo dõi quá trình đáp ứng miễn dịch thông qua hàm lượng kháng thể thấy: đáp ứng miễn dịch của chó tốt hơn so với thỏ. Cụ thể hiệu giá kháng thể trung hòa virus Care trong huyết thanh chó đạt 9,12 log2, trong khi thỏ chỉ đạt hiệu giá kháng thể là 7,24 log2. Nhưng chúng tôi nhận thấy rằng để sản xuất kháng thể với quy mô lớn thì sản xuất ở trên thỏ sẽ thuận lợi hơn rất nhiều so với ở chó, vì thỏ dễ nuôi sạch trong điều kiện thí nghiệm, thỏ không mắc hay mang những mầm bệnh truyền nhiễm của chó. Mặt khác, hàm lượng kháng thể ở thỏ cũng đáp ứng được yêu cầu cho sản xuất nên chúng tôi lựa chọn thỏ để tiếp tục nghiên cứu.
4.2.1.2. Nghiên cứu xác định độ tuổi động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể Sau khi xác định sử dụng thỏ làm đối tượng động vật để chế tạo kháng thể, chúng tôi nghiên cứu xác định độ tuổi của thỏ phù hợp cho sản xuất. Thỏ non quá
2.20
5.36
7.24
9.20 9.12
1.72
3.04
4.92
6.32
7.24
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
7 14 28 42 56
Log 2
Chó Thỏ
Ngày
thì hệ miễn dịch chưa hoàn thiện nên có thể ảnh hưởng đến khả năng sản xuất kháng thể. Thỏ ở lứa tuổi cao quá thì ảnh hưởng đến tiến độ sản xuất. Chúng tôi lựa chọn 03 nhóm thỏ ở giai đoạn 02 tháng, 03 tháng và 04 tháng để thí nghiệm.
Thỏ ở cả 3 lô này đều được tiêm virus nhược độc Care theo sơ đồ gây tối miễn dịch ở Hình 4.7. Ngày thứ 56 kể từ khi tiêm mũi đầu, chúng tôi lấy máu kiểm tra kháng thể ở cả 03 nhóm. Kết quả trình bày ở hình 4.7.
Ghi chú: a, b: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05
Hình 4.7. Hiệu giá kháng thể Care theo lứa tuổi động vật
Kết quả nghiên cứu cho thấy thỏ 2 tháng tuổi đáp ứng miễn dịch thấp nhất chỉ đạt (6,4 log2), thỏ 3 và 4 tháng tuôi cho hiệu giá kháng thể là (7,4 log2). Vì vậy chúng tôi chọn thỏ 3 và 4 tháng tuổi để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
4.2.1.3. Nghiên cứu xác định quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể
Chúng tôi đã xây dựng 03 quy trình tiêm virus nhược độc Care nhược độc cho thỏ với mục đích tìm ra quy trình giúp thỏ tạo ra hàm lượng kháng thể nhiều nhất để sản xuất.
Quy trình 01: Tiêm 5 lần vào ngày 0, 14, 28, 42, 56.
Quy trình 02: Tiêm 6 lần vào ngày 0, 14, 28, 42, 56, 70.
6,4a
7,4b 7,4b
5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6
Thỏ 2 tháng tuổi Thỏ 3 tháng tuổi Thỏ 4 tháng tuổi
Log 2
Quy trình 03: Tiêm 7 lần vào ngày 0, 14, 28, 42, 56, 70, 84.
Kiểm tra kháng thể vào ngày 98, 112, 126 ở cả 03 quy trình. Kết quả trình bày ở hình 4.8.
Hình 4.8. Hiệu giá kháng thể Care theo quy trình tiêm
Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu giá kháng thể thu được ở quy trình 01 thấp hơn so với kết quả đạt được ở quy trình 02 và 03 cụ thể ở quy trình 01 hiệu giá kháng thể thu được ở ngày 98 là (7,8 log 2); còn ở quy trình 02 và 03 hiệu giá kháng thể đạt được ở thời điểm này là (9,4 log2). Ở ngày 112 kiểm tra hàm lương kháng thể ở qui trình 01 là (7,6 log2); qui trình 02 và 03 đạt (9,2 log2 và 9,4 log2) cao hơn qui trình 01. Ở ngày kiểm tra 126 cũng cho kết quả tương tự. Chứng tỏ ở quy trình 02 và 03 tiêm virus nhược độc cho thỏ có kết quả tạo miễn dịch cao hơn.
Để thuận tiện cho quá trình sản xuất, chúng tôi lựa chọn quy trình 02 với số lần tiêm ít hơn (6 lần tiêm) so với quy trình 03 là (7 lần tiêm) nhưng kết quả vẫn đạt hàm lượng kháng thể cao tương đương.
4.2.1.4. Sơ đồ quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care + Kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ
- Thỏ khoẻ mạnh, khối lượng từ 2,5 kg - 3,5 kg. Thỏ không dùng trong bất
7.8 7.6 7.6
9.4 9.4 9.2 9.4 9.2 9.2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
98 112 126
Log 2
Ngày kiểm tra
Quy trình 1 Quy trình 2 Quy trình 3
cứ thử nghiệm nào trước đây. Để thỏ thích nghi với điều kiện môi trường nuôi ít nhất 7 ngày trước khi thực hiện thử nghiệm và theo dõi thỏ trong suốt giai đoạn này (thức ăn, nước uống và trọng lượng).
- Trước kỳ thử nghiệm, cân trọng lượng từng con thỏ và chọn những thỏ đạt tiêu chuẩn: khỏe mạnh, mắt sáng, lông mượt, không dị tật và không bị bệnh ngoài da. Thỏ phải có lý lịch, nguồn gốc rõ ràng.
- Số lượng thỏ của mỗi mẫu được cân để xác định trọng lượng ban đầu và đánh dấu theo thứ tự trên từng con. Chia mỗi con vào một chuồng và có bảng theo dõi riêng.
- Mỗi chuồng nuôi thỏ dùng để thử nghiệm phải có chai nước và hộp thức ăn.
Hàng ngày phải thay nước, thức ăn và vệ sinh chuồng để đảm bảo vệ sinh.
- Trước ngày thử nghiệm để thỏ nhịn ăn qua đêm chỉ cho uống nước. Trước khi bắt đầu tiêm, đặt thỏ vào gông ở vị trí ổn định trên bàn ít nhất 60 phút. Đo nhiệt độ thỏ 03 lần, mỗi lần cách nhau 60 phút. Thỏ phải có nhiệt độ ban đầu nằm trong khoảng 38 - 39,8ºC. Những thỏ có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo ≤ 0,6ºC và ngay trước khi tiêm chênh lệch nhiệt độ giữa 2 lần đo cách nhau 30 phút ≤ 0,2ºC được dùng vào thử nghiệm.
+ Cách đo nhiệt độ
Dùng nhiệt kế đầu dò có bôi vaselin đặt sâu vào trực tràng thỏ không ít hơn 5cm.
+ Liều tiêm
- Tiêm mỗi thỏ 2ml/con với nồng độ virus Care đã nhược độc 5 lần (cô đặc từ liều vaccin đang bán trên thị trường là 10^ TCID50/Liều).
- Tiêm 6 mũi cách nhau 14 ngày. Sau khi tiêm sẽ tiến hành đo và theo dõi nhiệt độ.
+ Đường tiêm và cách tiêm
Lấy lượng mẫu tiêm vào bơm tiêm đúng với thể tích cần tiêm. Làm ấm mẫu thử từ 37 - 38ºC. Mỗi mẫu thử được tiêm vào tĩnh mạch tai 3 thỏ có nhiệt độ ban đầu chênh lệch nhau không quá 1ºC, tốc độ tiêm chậm 2ml, nhưng thời gian tiêm không kéo dài quá 4 - 6 phút.
+ Theo dõi sau tiêm
Sau khi tiêm thỏ 60 phút đo nhiệt độ thỏ lần đầu. Sau đó, cứ 60 phút đo một lần trong vòng 3 giờ sau tiêm. Nhiệt độ cao nhất của thỏ được ghi nhận trong vòng 3 giờ sau khi tiêm được gọi là nhiệt độ tối đa.
Đo nhiệt độ thỏ sau tiêm 3, 6, 24, 48 và 72 giờ.
+ Kết quả lấy mẫu máu và tách huyết thanh thỏ
Tất cả các thỏ thí nghiệm được lấy máu trước khi bắt đầu tiêm virus Care
nhược độc mũi đầu tiên. Các mũi tiêm tiếp theo được tiêm cách mũi tiêm trước 14 ngày.
Mẫu máu thỏ được ly tâm ở 3.000 vòng/phút/15 phút, tách huyết thanh cho vào ống falcol và bảo quản ở -20oC. Kết quả tách huyết thanh cho thấy, tổng số huyết thanh/mẫu thu được của các thỏ lô 1, lô 2, lô 3 tương ứng là: 1350 ml/3765 ml, 1320/3990 ml, 1400 ml/3930 ml. Các thỏ khác nhau cho tổng lượng huyết thanh/mẫu khác nhau là do trạng thái của từng thỏ tại thời điểm lấy mẫu và do kỹ thuật thu huyết thanh của từng đợt.
Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể
Sau khi tách chiết, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh qua đó phản ánh mức độ đáp ứng miễn dịch.
Chúng tôi xây dựng sơ đồ tóm tắt quy trình chế tạo kháng thể Care sau khi đã xác định đối tượng động vật, lứa tuổi và quy trình gây miễn dịch. Kết quả bằng hình ảnh cho thấy: Những thỏ được lựa chọn cho sản xuất sẽ được tiêm virus Care nhược độc 6 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày. Sau lần tiêm cuối cùng 14 ngày toàn bộ số thỏ thí nghiệm sẽ được lấy máu để thu huyết thanh (lấy máu từ động mạch) được hòa chung rồi ly tâm, chắt huyết thanh. Tuy nhiên, đây mới chỉ là huyết thanh thô và cần phải tinh chế để loại bỏ những thành phần không cần thiết, chỉ giữ lại kháng thể. Lượng huyết thanh sau khi tinh chế sẽ được kiểm tra chỉ tiêu vô trùng, thuần khiết và đánh giá hàm lượng kháng thể. Khi đạt yêu cầu, bán thành phẩm sẽ được bổ sung chất bảo quản rồi chia liều hoàn thiện. Bước cuối cùng trong sản xuất là kiểm nghiệm thành phẩm và nhập kho.
Quy trình chế kháng thể được trình bày ở Hình 4.9
Hình 4.9. Sơ đồ chế kháng thể Care trên thỏ