Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật này thành phần hóa học chủ yếu là các alkaloid, vì vậy các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này cũng định hướng theo tác dụng sinh học của loại hợp chất đó.
Rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh các hợp chất trong loài Bình vôi có hoạt tính vô cùng phong phú như an thần, gây ngủ, kháng viêm, giảm đau, kháng virus, chống lại tế bào ung thư…
• Độc tính cấp của L - tetrahydropalmatine (Rotundine)
Nghiên cứu thử độc tính cấp của L-tetrahydropalmatine, thuốc được đưa vào dạ dày qua đường miệng. Kết quả LD50 của L-tetrahydropalmatine hydroclorid là 1000 mg/kg thể trọng chuột [22]. Một nghiên cứu khác đã thử độc tính của Rotundine hydroclorid đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa. Kết quả cho thấy ở liều 150 mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng, thuốc tạo giấc ngủ sâu kéo dài tới 36 giờ và không thấy biểu hiện khác thường so với lô chuột đối chứng [26]. Rotundine sulfat có LDo bằng đường tiêm tĩnh mạch trên chuột nhắt trắng là 118,3±10,06 mg/kg thể trọng theo phương pháp của P. Z.
Livchitch cho thấy thuốc tương đối ít độc [12].
Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm Rotundine liều cao trên chuột (150 mg/kg thể trọng chuột) tương đương với 7,5 g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc - 1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn khá cao của chế phẩm. Rotundine ít độc, khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1÷2 ngày [27].
• Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương
Một nghiên cứu thăm dò tác dụng của L-tetrahydropalmatine trên điện não thỏ. Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não. Kết quả của thử nghệm cho thấy sau khi cho thỏ uống L-tetrahydropalmatine với liều 100 mg/kg thể trọng thỏ trong 7 ngày liền cho thấy tăng thành phần sóng chậm 𝛿 và giảm thành phần sóng nhanh 𝛽 chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatine có tác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể lưới thân não [32], [34].
Nghiên cứu khi tiêm 0,1 ml dung dịch L-tetrahydropalmatine trên chuột nhắt trắng ở các nồng độ khác nhau: 0,5%, 1%, 2% nhận thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì trong vòng 3-5 giờ [20].
D-tetrahydropalmatine và L-tetrahydropalmatine được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania còn có tác dụng an thần gây ngủ. Thí nghiệm thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của L-tetrahydropalmatine trên chuột nhắt trắng cho thấy L-tetrahydropalmatine đã kéo dài giấc ngủ của pentotal rất rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơm trực tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ của chuột lên 8 lần [34].
Khi dùng theo đường tiêm bắp, thuốc tiêm Rotundin sulfat có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [12].
• Tác dụng kháng viêm
Cepharanthine có tác dụng chống viêm, tiêu sưng. Tetrandrine được sử dụng để chữa các khiếm khuyết của hệ miễn dịch, bệnh tăng huyết áp ở Trung Quốc và còn là một chất rất có triển vọng trong việc điều trị bệnh viêm khớp mạn tính. Tetrandrine ức chế các cytokine tiền viêm, ức chế quá trình biểu hiện iNOS và COX-2 ở tế bào bạch cầu đơn nhân người. Tetrandrine có khả năng bảo vệ tế bào đảo tụy tránh khỏi tổn thương gây ra do alloxan trên chuột [130]. Tetrandrin ức chế sự hoạt hóa NF-KB, do đó cải thiện được viêm trực tràng gây ra bởi dextran sulfat natri ở chuột [149]. Tetrandrine có tác dụng bảo vệ tế bào trên mô hình viêm gan gây ra bởi conconavalin - A [67]. Khi dùng đường uống trên chuột ở liều 250 mg/kg, cho tác dụng kháng viêm trên mô hình gây phù nề chân chuột bằng carrageenine chỉ trong vòng 1 giờ (74,3%), sau đó tác dụng giảm [51].
• Tác dụng chống tăng sinh khối u và chống ung thư
Nghiên cứu cho thấy Cepharanthine có tác dụng giảm sự đào thải thuốc chống ung thư ra khỏi tế bào do đó làm tăng tác dụng của một số thuốc như adriamycine [110]. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm thuốc Biscoclaurine lên dòng tế bào da kháng phát sinh từ dòng tế bào ung thư KB ở người kết quả Cepharanthine có tác dụng tốt trên dòng tế bào đa kháng chủ yếu do khả năng gắn của thuốc với phosphatidylserine trên mạng bào tương và làm rối loạn chức năng của màng [125]. Cepharanthine có tác dụng điều hòa sự kháng đa thuốc ở tế bào ung thư đường tiêu hóa do đó có khả năng khắc
phục được sự kháng doxorubicine ở bệnh nhân ung thư [77]. Cepharanthine có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư do khởi động quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [69]. Khả năng ức chế của Cepharanthine với sự phát triển của các tế bào ung thư biểu mô dạng vẩy ở miệng rất đỏng kể với nồng độ ức chế dao động trong khoảng 10ữ20 àg/ ml [75]. Cepharanthine có tác dụng đối kháng mạnh với MRP7 theo cơ chế cạnh tranh. Điều này làm sáng tỏ phần nào cơ chế chống ung thư của Cepharanthine [155]. Cepharanthine có khả năng điều chỉnh sự vận chuyển qua màng của bào tương của irinotecan do đó chống lại được sự kháng của tế bào ung thư vú với thuốc chống ung thư này [37]. Thử nghiệm in vitro cho thấy Tetrandrine ức chế phân bào và gây cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư gan HepG - 2 với giỏ trị IC50 = 9,0+1,0 àM [144]. Tetrandrine cú tỏc dụng làm ngừng sự phát triển tế bào ung thư của trực tràng. Tetrandrin làm tăng tác dụng của các thuốc chống ung thư trên dòng tế bào ung thư phổi.
Theo nghiên cứu Tetrandrine còn có tác dụng bảo vệ chọn lọc chống lại protein Amyloid-b trong điều trị u nguyên bào thần kinh [56].
• Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Dịch chiết ethanol có tác dụng kháng khuẩn in vitro đối với vi khuẩn Bacillus cereus, Escherichia coli và Staphylococcus aureus (phương pháp khuếch tỏn trờn đĩa). Ức chế rừ rệt trờn Artemia sp. với LC50 là 260,26 àg/ml.
Liều gây độc/liều gây chết đối với vi khuẩn của dịch chiết là 750 mg/kg. Ức chế nấm Tyrosinase với IC50 là 1,74 mg/ml trong thử nghiệm với phương pháp Dopachrome [103].
• Tác dụng chống oxi hóa
Một nghiên cứu đã phát hiện Tetrandrine có hoạt tính chống oxi hóa.
Dịch chiết ethanol, methanol cũng có tác dụng chống oxy hóa với EC50 là 4,98 mg/ml trên thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH [103]. Dịch chiết methanol cũng có tác dụng chống oxi hóa tương tự dịch chiết ethanol (trên thử nghiệm dọn gốc
tự do DPPH và thử nghiệm FRAP (đánh giá khả năng giảm hoạt tính chống oxi hóa của sắt) [103].
• Ức chế sự nhân lên của virus
Cepharanthine phân lập từ loài Stephania cepharantha Hayata có khả năng ức chế mạnh đối với sự nhân lên của virus HIV typ I [115].
Tetrandrine có tác dụng ức chế viêm giác mạc do virus herpes simplex typ I (HSV) gây ra ở chuột. Hai chất Aromoline và FK - 3000 phân lập từ dịch chiết methanol của loài Stephania cepharantha Hayata có khả năng kìm hãm HIV typ 1 rất mạnh. Hợp chất FK 3000 (phân lập từ loài Stephania cepharantha Hayata) còn có hoạt tính mạnh với 2 virus herpes simplex là HSV typ 1 và HSV typ 2 [106].
• Bảo vệ tế bào
Cepharanthine bảo vệ tế bào chống lại những hậu quả do nội độc tố, do khả năng ức chế sản xuất nitric oxid trong trường hợp sốc nhiễm khuẩn [121].
Theo một nghiên cứu khác, Cepharanthine còn có tác dụng bảo vệ ADN trong quá trình tổn thương tế bào gây ra bởi các tác nhân oxi hóa [75].
• Một số hoạt tính khác
Nghiên cứu tác dụng của Cycleanine trên tim, kết quả cho thấy có tác dụng đối kháng calci chọn lọc trên mạch máu [108]. Cycleanine có tác dụng ức chế bơm Na+-K+-ATPase [122]. Tiến hành thử nghiệm Cycleanine cho thấy thuốc có hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét mạnh đối với cả hai dòng Plasmodium falciparum D - 6 và W - 2 ở động vật có vú [102]. Stepholidine có tác dụng trong điều trị bệnh nhân tâm thần phân liệt và giảm một số triệu chứng của bệnh Parkinson. Stepholidine có tác dụng trong điều trị cai nghiện thuốc phiện (morphine) [139]. Crebanine có tác dụng chống loạn nhịp tim [145].
Dehydrostephanine và Dehydrocrebanine có hoạt tính chống sốt rét [102]. Thử nghiệm trên tế bào lông của da chuột 52 alkaloid từ loài Stephania cepharantha Hayata và phát hiện Cepharanoline và Berbamine có hoạt tính tăng sinh đáng kể đối với tế bào lông [112].
Chương 2 THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu củ loài Stephania cepharantha Hayata. Được thu hái tại Yên Tử - Quảng Ninh vào tháng 11 năm 2020 do TS. Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học.
Mẫu được bảo quản tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ - Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất
2.2.1.1. Hóa chất dùng để phân lập các chất từ củ loài Stephania cepharantha Hayata
Các dung môi sử dụng: ethanol, methanol, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, nước cất đều là dung môi tinh khiết.
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm.
Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197÷400 mesh (0,040÷0,063 mm).
Sắc ký cột nhanh: sử dụng silicagel cỡ hạt 70÷200 mesh.
Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài (254 nm; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilline - H2SO4, hơ nóng trên bếp điện cho đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất.
2.2.1.2. Hóa chất dùng để định tính một số nhóm hợp chất có trong cặn chiết ethanol loài Stephania cepharantha Hayata
Hóa chất dùng để phản ứng màu định tính một số nhóm hợp chất: muối sắt (III), H2SO4 đặc, tinh thể (Bi(NO3)3.5H2O), dung dịch acetic acid 20%, dung
dịch NaOH 10%, tinh thể HgCl2, HCl đặc 36%, bột Mg kim loại, dung dịch CH3OH, dung dịch KI 40%, anhydrid acetic.
2.2.1.3. Vật liệu và dòng tế bào dùng để thử hoạt tính ức chế Nitric oxide Vật liệu: LPS từ Escherichia - coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), DMEM và FBS được cung cấp từ Life Technologies, Inc, (Gaithersburg, MD, USA).
Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1- napthylethylenediaminedihydrochloride và DMSO của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Các hóa chất cần thiết khác của hãng Sigma, GiBCO, Invitrogen, Promega.
Dòng tế bào: RAW 264.7 do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia và GS.TS. Chi-Huang, Đại học quốc gia Yang-Ming, Taiwan cung cấp.
2.2.2. Thiết bị
Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz
Đĩa 96 giếng, pipet, eppendorf và các thiết bị phụ trợ khác.
Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader.
Bộ Griess Reagent System (Promega Coopertion, WI, USA).
Máy microplate reader ở bước sóng 540 nm.
Tử ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz)
Tủ lạnh sâu -250C, -800C, buồng tế bào (Fisher, Hoa kỳ)
Máy quang phổ (Genios Tecan) và bình nitơ lỏng bảo quản tế bào.
2.3. Phương pháp phân lập; xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học 2.3.1. Xử lý mẫu thực vật
Mẫu nguyên liệu củ loài Stephania cepharantha Hayata được rửa sạch, cạo vỏ, sấy khô; thái miếng với kích cỡ 4×6 cm và hong khô ở tủ sấy ở 40oC; sau 4 ngày được nguyên liệu khô, sau đó chiết mẫu khô bằng ethanol 900.
2.3.2. Chiết tách các chất
Ngâm nguyên liệu khô trong ethanol 90o trong 24h×4, kết hợp siêu âm để tăng hiệu quả chiết thu được dịch chiết 4 lần. Gộp dịch chiết, quay cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethanol BVE.
Tiến hành thí nghiệm định tính các thành phần hóa học có trong cặn chiết ethanol củ loài Stephania cepharantha Hayata.
Phân lập cặn chiết ethanol BVE thu được bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp.
2.3.3. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối lượng ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và một số phương pháp khác.
2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế Nitric oxide
Hoạt tính ức chế nitric oxide của mẫu nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 sau đó làm phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT
2.3.4.1. Nuôi cấy tế bào in vitro
- Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1.0 mM sodium pyruyate, ngoài ra bổ sung 10% FBS (GIBCO).
- Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2.
2.3.4.2. Xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 - Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2×105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 370C và 5% CO2 trong 24h.
- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h.
- Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kớch thớch sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 àg/ml) trong 24h.
- Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng trong dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là L - NMMA (sigma) ở cỏc nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 m àg/ml.
- Nitrie (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 àl mụi trường nuụi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thờm vào 100 àL Griess reagent: 50 àl of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5%
(v/v) phosohoric acid và 50 àl 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylene diamine dihydrochloride pha trong nước.
- Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blanks).
- Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).
- Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức:
% ức chế = 100% - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50
(nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4. [43], [49], [58], [100], [136].
2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Quá trình phân lập các chất từ mẫu củ loài Stephania cepharantha Hayata 2.4.1.1. Quy trình tạo cặn chiết ethanol
Quy trình tạo cặn chiết ethanol từ củ của loài Stephania cepharantha Hayata được trình bày theo sơ đồ 2.1.
Mẫu củ của loài Stephania cepharantha Hayata (1,8 kg) được rửa sạch, cạo vỏ, thái nhỏ thu được 1,62 kg nguyên liệu tươi; sấy ở 40oC thu được 450 gam mẫu củ khô, xay nhỏ. Ngâm mẫu củ khô trong etanol 90o, vớt và lọc bã, quay cất thu hồi dung môi được 89 g cặn chiết ethanol (BVE)
2.4.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethanol
Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết ethanol mẫu củ của loài Stephania cepharantha Hayata được trình bày theo sơ đồ 2.1.
Lấy 50 g BVE hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi EtOAc /MeOHvà trộn với silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.
Silicagel Merck (cỡ hạt 0,043÷0,063 mm) được nhồi vào cột sắc ký theo phương pháp nhồi ướt với dung môi ban đầu là EtOAc 100%. Sau khi cột đã ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên cột và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là EtOAc: MeOH: H2O có độ phân cực tăng dần thu được các phân đoạn khác nhau. Từ các phân đoạn này được gộp thành các phân đoạn có kí hiệu là: BVE2 và BVE12, theo kết quả kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng.
Phân đoạn BVE2 thu được chất rắn kết tinh, màu vàng, lọc và rửa sạch bằng dung môi nhiều lần được 319 mg chất, ký hiệu là SC1.
Sắc kí lại trên cột silicagel chất rắn xuất hiện ở phân đoạn BVE12 được chất rắn kết tinh, màu trắng, khối lượng 354 mg, kí hiệu là SC2.
Chất SC1: 319 mg hiệu suất 1,27 ×10-1 % so với trọng lượng mẫu củ khô 450 g Chất SC2: 354 mg hiệu suất 1,41 ×10-1 % so với trọng lượng mẫu củ khô 450 g Quy trình chiết tách và phân lập hai chất trên được thể hiện trên sơ đồ 2.1
Sơ đồ 2.1. Quy trình phân lập các hợp chất từ mẫu củ loài Stephania cepharantha Hayata
Mẫu củ Bình vôi (Củ tươi - 1,8 kg)
Cặn chiết BVE (89 g)
Rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô
Sắc kí cột Silicagel = EtOAc: MeOH: H2O với lượng MeOH tăng dần từ 5 – 100%, H2O tăng dần từ 2 – 20%
Phân đoạn BVE2
Phân đoạn BVE12
Sắc kí cột Silicagel
= CH2Cl2: MeOH tỉ lệ 5: 0,1
Mẫu củ khô (450 g)
Chiết trong Ethanol 90oC, siêu âm âm
Chất rắn SC1 (319 mg)
Lọc và rửa sạch bằng dung môi
Chất rắn kết tinh màu vàng
Sắc kí cột Silicagel
= CHCl3: MeOH tỉ lệ 5: 0.5
Chất rắn SC2 (354 mg)
Dùng 50 g BVE
Chất rắn kết tinh màu trắng
Lọc và rửa sạch bằng dung môi