PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÙM NGÂY NHẬP NỘI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD
4.2.2. Kết quả phân tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD
Đánh giá đa dạng di truyền để khai thác sử dụng nguồn gen là vô cùng cần thiết góp phần hữu ích trong công tác chọn tạo giống. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các giống Chùm ngây, ngoài sử dụng các đặc điểm hình thái, việc áp dụng chỉ thị phân tử, cụ thể là chỉ thị RAPD được coi là phương pháp hữu hiệu nhất.
RAPD là chỉ thị nhân ngẫu nhiên các đoạn DNA trong genome trên cơ sở phương pháp PCR dùng một đoạn mồi. Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở một vị trí bất kỳ mà tại đó có trình tự bổ sung với nó. Chỉ thị RAPD phát hiện tính đa dạng đáng tin (sự mất đoạn nhiễm sắc, sự thay đổi, thêm bớt nucleotit, xen đoạn,… đều làm thay đổi kích thước đoạn nhân bản).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
4.2.2.1. Tối ưu nồng độ MgCl2 và dNTP trong phản ứng PCR-RAPD
Kết quả của chỉ thị phân tử RAPD phụ thuộc rất nhiều yếu tố như nồng độ Tag polymerase, Mg2+, dNTP, chất lượng DNA, nhiệt độ bắt mồi [23]. Vì vậy việc tối ưu nồng độ phản ứng của MgCl2 (25 Mm) và dNTP (10 Mm) sẽ đạt kết quả cao.
Tiến hành bố trí thí nghiệm 9 công thức (CT) như Sơ đồ 4.1, sử dụng giống ĐC và giống Philippin.
MgCl2 (25 Mm)
dNTP(10 Mm) 0,5(àl) 1,0(àl) 1,5(àl)
0,5 (àl) CT1 CT4 CT7
1,0 (àl) CT2 CT5 CT8
1,5 (àl) CT3 CT6 CT9
Sơ đồ 4.1. Thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và dNPT trong phản ứng RAPD
Kết quả thu được như Hình 4.2 khi thực hiện phản ứng RAPD với các nồng độ MgCl2 và dNTP khác nhau, nhận thấy ở CT1, CT5, CT8 xuất hiện 5 phân đoạn DNA;
CT4, CT7, CT9 xuất hiện 3 phân đoạn DNA; CT2, CT6 chỉ xuất hiện 1 phân đoạn DNA và ở CT3 không xuất hiện phân đoạn nào.
Như vậy CT1, CT5, CT8 xuất hiện các phân đoạn DNA đa hình ở 2 giống Địa phương và Philippin
Hình 4.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR-RAPD với các nồng độ MgCl2
và dNTP khác nhau..
[M: 100 bp DNA ladder, I:CT1, II:CT2, III:CT3, IV:CT4, V:CT5, VI:CT6, VII:CT7, VIII:CT8, IX:CT9][1: Địa phương, 2: Philippin]
Dựa vào kết quả xuất hiện nhiều phân đoạn DNA nhất trên hai giống ĐC và Philippin, chúng tôi tiến hành kiểm chứng CT1, CT5, CT8 trên lần lượt 5 giống đại diện là: ĐC, VI047492, Thái Lan, PKM-1 và Philippin cho mỗi công thức. Kết quả thu được như Hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD sử dụng CT1, CT5, CT8
[I: CT1, VI: CT5, VIII: CT8][1: ĐC, 2: VI047492, 3: Thái Lan,4: PKM-1, 5:
Philippin] Mũi tên chỉ các đoạn DNA đa hình đại diện
Hình 4.3 cho thấy, ở công thức I có sự xuất hiện các phân đoạn DNA đa hình, rõ nét trong khi công thức V và công thức VIII không xuất hiện. Kết quả trên cũng cho thấy, nồng độ MgCl2 và dNTP là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự biểu hiện của các mồi đa hình.
Tiến hành các phản ứng PCR-RAPD tiếp theo chúng tôi sử dụng nồng độ MgCl2
và dNTP như cụng thức I, cỏc thành phần tham gia mỗi phản ứng gồm 15 àl, trong đú:
Nước cất vụ trựng: 4,8 àl; 5X buffer: 3 àl; MgCl2 (25Mm): 0,5 àl; dNTP (10Mm): 0,5 àl; primer: 1 àl; Taq polymerase: 0,2 àl và DNA: 5 àl.
4.2.2.2. Khảo sát chỉ thị RAPD
Để phân tích đa hình DNA của 8 giống nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng 90 mồi để khảo sát tính đa hình trên 5 giống đại diện, đó là: Giống ĐC, VI047492, Thái Lan, PKM-1, Philippin. Từ những kết quả điện di của 5 giống trên với 90 mồi RAPD cho thấy có 23 mồi khuếch đại biểu hiện đa hình giữa các giống (Hình4.4). Các mồi còn lại hoặc không nhân lên được đoạn DNA nào hoặc chỉ có 1 đoạn, không có ý nghĩa trong việc xác định đa hình DNA.
Hình 4.4. Kết quả điện di của một số mồi RAPD
[M: 100 bp DNA ladder, 1: ĐC, 2: VI047492, 3: Thái Lan, 4: PKM-1, 5:
Philippin] Mũi tên chỉ các đoạn DNA đa hình đại diện
Để kiểm chứng các mồi đa hình, chúng tôi tiếp tục sử dụng 23 mồi đa hình này để phân tích 5 giống đã được sử dụng ở trên để so sánh kết quả khuếch đại của các mồi RAPD. Kết quả cho thấy 6 trong 23 mồi biểu hiện đa hình cho các phân đoạn DNA rõ nét và dễ cho điểm (Hình 4.5). Số mồi đa hình này sẽ được sử dụng để đánh giá kiểu gen của các cá thể thuộc 8 giống Chùm ngây phục vụ nghiên cứu đa dạng di truyền.
Hình 4.5. Kết quả điện di của một số mồi RAPD biểu hiện đa hình [1:ĐC, 2: VI047492, 3: Thái Lan, 4: PKM-1: 5: Philippin]
Mũi tên chỉ các đoạn DNA biểu hiện đa hình đại diện