Helrick (1997), cho biết hệ vi khuẩn hiếu khí ô nhiễm thực phẩm được hiểu bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn yếm khí tùy tiện, chúng xuất phát từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Thông qua việc xác định chỉ tiêu tổng số vi khuản hiếu khi cho phép sơ bộ nhận định tổng quan chung về tình trạng vệ sinh thực phẩm.
Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí được xem là phương pháp tốt nhất để ước lượng số vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm.
Avery (2000), cho biết hệ vi khuẩn có mặt trong thịt được chia thành hai nhóm, dựa theo mức độ và điều kiện phát triển của chúng gồm nhóm ưa nhiệt và nhóm ưa lạnh (ưa nhiệt phát triển tốt nhất ở 370C, ngừng phát triển ở nhiệt độ thấp khoảng 10C; ưa lạnh sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt độ thấp hơn), việc phân nhóm này chỉ có ý nghĩa tương đối.
Ingram và Simonsen (1980), cho rằng vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển trong phạm vi nhiệt độ từ 00C - 300C, song nhiệt độ tối ưu là 100C - 150C. Morita (1975), cho rằng vi khuẩn nhóm này phát triển ở nhiệt độ thấp hơn, chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 00C nhưng không sinh trưởng và phát triển được ở nhiệt độ 200C, nhiệt độ tối ưu đối với vi khuẩn này là 00C - 150C hoặc thấp hơn. Grau F. H (1986), lại cho rằng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển vi khuẩn ưa lạnh là 200C, chúng khó phát triển ở nhiệt độ 350C - 370C.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt có thể thay đổi theo thời gian, điều kiện sản xuất và bảo quản. Vi khuẩn ưa nhiệt có thể xâm nhập vào thân thịt ngay sau khi giết mổ, bởi vậy cần kiểm tra nhóm vi khuẩn ưa nhiệt ở nhiệt độ nuôi cấy từ 350C - 370C.
Theo TCVN (2005), nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm có thể áp dụng cho mọi vùng là 300C.
Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có ý nghĩa đánh giá sơ bộ chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. Tuy nhiên, không thể đánh giá rằng tổng số vi khuẩn ở mức độ thấp có nghĩa là sản phẩm an toàn. Trong một số trường hợp, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí thấp nhưng chứa độc tố gây ngộ độc của vi khuẩn, ví dụ như độc tố enterotoxin của St.aureus. Hay trong trường hợp thực phẩm lên men không thể đánh giá chất lượng vệ sinh theo tiêu chí này.
Để kiểm tra chỉ tiêu VSTP bắt buộc chúng ta phải kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thực phẩm, thông qua đó nói lên điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian bảo quản thực phẩm, nó được coi là phương pháp tốt nhất để xác định lượng vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm (Herbert, 1997).
1.6.2. Vi khuẩn Escherichia coli
E.coli là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae, là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng. Vi khuẩn gram (-), hỡnh gậy ngắn, hai đầu trũn, cú lụng di động mạnh, kớch thước 2-3 x 0,4-0,6à. Vi khuẩn E.coli không sinh nha bào, một số có màng nhầy xung quanh và có thể có giáp mô. E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, phát triển ở nhiệt độ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH: 7,2 - 7,4, cũng có thể phát triển ở pH 5,5 - 8,0.
Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, lên men nhưng không sinh hơi các loại đường sarcharose, ducitol, salixin. Thử nhóm phản ứng sinh hoá IMViC cho kết quả (++-- ) hoặc (-+--).
E.coli có sức đề kháng kém, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút. Các chất sát trùng thông thường như nước Javel 0,5%, phenol 0,5% diệt được E.coli sau 2 - 4 phút.
Khi nghiên cứu độc tố của E.coli người ta chú ý 2 loại độc tố đường ruột sau:
- Độc tố chịu nhiệt ST (Heat Stable Toxin) chịu được ở nhiệt độ 1200C trong vòng 1 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, nhưng bị phá huỷ nhanh chóng khi hấp cao áp.
- Độc tố không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin) bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút.
E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, có 3 loại kháng nguyên O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên lông) và K (kháng nguyên bề mặt), trong đó kháng nguyên O được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn. E.coli có rất nhiều serotype nhưng chỉ có một phần nhỏ là có khả năng gây bệnh. E.coli sống ký sinh trong đường ruột với tỷ lệ cao (80 - 100%) so với các vi khuẩn hiếu khí khác và là tác nhân gây bệnh có điều kiện vì bình thường vi khuẩn cư trú trong ruột mà không gây bệnh. E.coli trở thành gây bệnh khi chúng phát triển nhân lên chiếm ưu thế trong hệ vi khuẩn đường ruột bằng yếu tố cạnh tranh và tiếp nhận được các yếu tố gây bệnh (Lê Văn Tạo, 2006).
Sinh học phân tử đã chứng minh E.coli có các plasmid mang các yếu tố di truyền có khả năng gây bệnh, đó là khả năng sinh độc tố Enterotoxin, Neurotoxin, Verotoxin...; khả năng sản sinh yếu tố gây dung huyết, yếu tố bám dính, yếu tố kháng kháng sinh. Với các yếu tố này E.coli vừa có khả năng truyền dọc qua plasmid trong quá trình phân chia của nó, vừa có khả năng truyền ngang bằng tiếp hợp.
E.coli còn có thể truyền các plasmid mang yếu tố gây bệnh cho một số loại vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) như Salmonella, Klebsiella, Vibrio cholerae (Nguyễn Văn Quang và cs, 2000).
Căn cứ vào khả năng và đặc điểm gây bệnh của E.coli người ta chia chúng thành 5 nhóm (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
- Enterophathogenic E.coli (EPEC) không sản sinh độc tố ruột, phá huỷ các vi nhung mao ruột thông qua các yếu tố bám dính bám vào màng nhày ruột. EPEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở trẻ nhỏ.
- Entrotoxigenic E.coli (ETEC) gồm những dòng mang yếu tố bám dính và xâm chiếm niêm mạc ruột non, tiết ra độc tố chịu nhiệt và độc tố không chịu nhiệt.
Gây tiêu chảy cả ở người lớn và trẻ nhỏ.
- Enteroinvasive E.coli (EIEC) không sản sinh độc tố ruột nhưng chúng nhân lên nhanh chóng ở biểu mô ruột và xâm lấn mạnh mẽ đến các vùng kế cận, tấn công đoạn kết tràng, xâm nhập vào máu hoặc không. Người già và trẻ em rất nhạy cảm với các chủng EIEC.
- Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) - Verotoxin producing E.coli (VTEC):
Các chủng VTEC có thể gây hội chúng tan máu, tăng ure huyết và các ban đỏ do thiếu tiểu cầu gây ra. Điển hình là E.coli O157:H7 được xem là nguyên nhân của nhiều vụ ngộ độc. E.coli O157:H7 sản sinh độc tố Verotoxin (VT) gây xuất huyết nội. Triệu chứng ngộ độc là đau bụng dữ dội, ỉa chảy ra nước hoặc lẫn máu, sốt, nôn mửa. Bệnh nhân có thể khỏi sau 10 ngày. Tuy nhiên ở một số người già và trẻ em, nhiễm độc vi khuẩn có thể nguy hiểm đến tính mạng, tỷ lệ tử vong từ 3 - 5%.
- Enteroadherent aggregative (EA-AggEC)
E.coli được xem là yếu tố chỉ điểm tình trạng vệ sinh trong quá trình chế biến thực phẩm.
1.6.3. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, không hình thành nha bào và giáp mô, gram (-). Hầu hết các Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ S. gallinarum và S. pullorum), vì vậy có khả năng di động. Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí, dễ nuôi cấy, pH thích hợp 7,6, nhiệt độ 370C. Nhưng có thể phát triển được ở pH 6 - 9, nhiệt độ 6 - 420C.
Các chủng Salmonella đều lên men sinh hơi các loại đường: glucose, galactose, fructose, maltose; không lên men các loại đường lactose, sarcharrose, salixin; không sinh Indol, sinh H2S.
Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 600C trong 1 giờ, ở 750C trong 5 phút. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng diệt vi khuẩn ở nước trong khoảng 5 giờ và nước đục sau 9 giờ. Trong xác chết, Salmonella có thể tồn tại 100 ngày, trong thịt ướp muối ở 6- 120C từ 4-8 tháng, thịt ướp ít có tác dụng diệt vi khuẩn Salmonella từ bên trong.
Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella rất phức tạp, bao gồm 3 loại là O, H và Vi. Kháng nguyên O được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nằm trên màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn. Kháng nguyên H chỉ có ở những Salmonella có lông.
Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng nguyên Vi chỉ có ở 2 type huyết thanh S. typhi và S. paratyphi C. Dựa
vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên để xếp loại Salmonella. Có hơn 2300 serotype Salmonella khác nhau, trong đó những type hay được nói tới là S.typhi, S.paratyphi, S.typhimirium và S.enteritidis (Trần Linh Thước, 2002).
Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra hai loại độc tố: nội độc tố và ngoại độc tố.
Người ta chỉ phát hiện được trên thực nghiệm nội độc tố phóng thích khi vi khuẩn bị phân giải. Độc tố do Salmonella sản sinh ra gồm 2 thành phần chính: độc tố thẩm xuất nhanh và độc tố thẩm xuất chậm.
- Độc tố thẩm xuất nhanh (RPF: Rapid Permeability Factor) của Salmonella có cấu trúc và hoạt tính giống với độc tố chịu nhiệt ST của E.coli và Vibrio cholera nên được gọi là độc tố chịu nhiệt (ST), có khả năng gây bệnh tích ở thành ruột, tăng sự thẩm thấu của tế bào niêm mạc.
- Độc tố thẩm xuất chậm (DPF: Delayed Permeability Factor) của Salmonella có cấu trúc và thành phần giống độc tố không chịu nhiệt LT của E.coli và Vibrio cholera nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt (LT), có khả năng tác động vào chu trình Adenyl làm rối loạn trao đổi muối và nước ở ruột gây tập trung nước vào lòng ruột.
Trong các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây nên, ngộ độc do Salmonella là nguy hiểm nhất, 49% các vụ ngộ độc thực phẩm do thức ăn chế biến từ thịt có liên quan đến Salmonella (Lowry and Bater, 1989). Salmonella là loại vi khuẩn nguy hiểm đối với sức khoẻ con người nên yêu cầu vệ sinh tối thiểu đặt ra cho tất cả các loại thực phẩm không được có mặt loại vi khuẩn này trong 25g mẫu thực phẩm (TCVN: 7046 - 2009). Điểm đáng chú ý, khi thực phẩm nhiễm Salmonella thì các tính chất của thực phẩm không bị thay đổi rõ rệt. Do đó để phòng tránh bệnh do Salmonella, người ta khuyến cáo không nên sử dụng thịt sống, tái hoặc thức ăn chín xử lý nhiệt không đúng cách.
1.6.4. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
St.aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ tiện, hình cầu đường kính khoảng 0,7à, gram (+). Dưới kớnh hiển vi thường thấy tụ cầu tập trung thành từng đám giống chùm nho. Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào. Nhiệt độ thích hợp từ 32 - 370C, pH 7,2 - 7,6.
Tất cả các dòng St.aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu. Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng
chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc. Hầu hết các dòng đều tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.
St.aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu được phân lập từ da, màng nhầy niêm mạc của người và động vật máu nóng. St.aureus có thể nhiễm vào thực phẩm trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm và làm hư hỏng thực phẩm.
Hầu hết các dòng St.aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi tăng trưởng ở 350C - 370C. Hiện nay người ta đã xác định St.aureus có 6 loại độc tố ruột (A, B, C1, C2, D và E) chúng khác nhau về độc tính, trong đó phần lớn ngộ độc thực phẩm là do type A và D (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
St.aureus là một trong các yếu tố độc hại về vi sinh vật gây ô nhiễm trong thực phẩm bắt buộc phải giám sát và kiểm tra. Sự có mặt của St.aureus trong thực phẩm phản ánh tình trạng vệ sinh hoặc nhiệt độ của quá trình chế biến thực phẩm không đạt yêu cầu. Tuy nhiên, để tìm bằng chứng của các vụ ngộ độc thực phẩm do St.aureus phải phát hiện ra khả năng sản sinh độc tố của những vi khuẩn này (W. Andrews, 1992). 90,95% thịt lợn tiêu thụ nội địa trên thị trường vùng hữu ngạn sông Hồng ô nhiễm St.aureus quá mức cho phép (Lê Minh Sơn, 2002).
1.6.5. Vi khuẩn Clostridium perfringens
Cl. perfringens là trực khuẩn gram (+), hình que, kỵ khí, không di động, có hình thành giáp mô trong cơ thể bệnh và ở bên ngoài môi trường có khả năng hình thành nha bào.
Tế bào vi khuẩn Cl.perfringens dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ đun nấu thông thường, nhưng nha bào của nó có khả năng đề kháng nhiệt cao.
Đặc tính gây bệnh của Cl.perfringens liên quan tới 4 loại độc tố gây chết do chúng sản sinh ra là Alpha, Beta, Epsilon và Iota, ngoài ra còn có độc tố ngoại bào enterotoxin gây ngộ độc thực phẩm ở người. Dựa theo các dạng độc tố gây chết mà chúng sản sinh ra, hiện tại chia Cl. perfringens thành 5 type khác nhau A, B, C, D và E. Trong đó, các type gây ngộ độc thực phẩm là A, C và D.
Cl. perfringens tồn tại trong đất, bụi, nước thải, trong đường tiêu hoá của người và gia súc (có thể tìm thấy trong nước tiểu). Ô nhiễm Cl.perfringens vào thịt phản ánh tình trạng vệ sinh giết mổ kém.
1.6.6. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm thịt tươi Bảng 1.2. Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi
Tên chỉ tiêu
Giới hạn tối đa Thịt miếng Thịt xay 1. Tổng số VSV hiếu khí, CFU trên gam sản phẩm 105 106
2. E. Coli, CFU trên gam sản phẩm 102 102
3. Salmonella, CFU trên 25 gam sản phẩm 0 0
4. Coliforms, CFU trên gam sản phẩm 102 102
5. Staphylococcus aureus, CFU trên gam sản phẩm 102 102 6. Clostridium perfringens, CFU trên gam sản phẩm 102 102