Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học 2.3.1.1. Đặc điểm hình thái
Dùng kính lúp cầm tay, thị kính và kính hiển vi quang học để quan sát các bộ phận, chụp hình minh họa.
Phân tích và mô tả đặc điểm hình thái của các bộ phận (thân, lá, hoa, căn hành).
2.3.1.2. Đặc điểm giải phẫu - Phương pháp cắt vi phẫu
+ Cầm mẫu vật cần cắt đặt trên bàn, dùng dao lam cắt mẫu thành những lát thật mỏng. Khi cắt, dao lam được đặt thẳng góc với mẫu vật.
+ Vị trí cắt trên mẫu vật thay đổi tùy theo cơ quan:
Đối với phiến lá: Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không sát đáy phiến.
Đối với rễ: Cắt ngang đoạn rễ có đường kính lớn hơn 1 mm.
Đối với cuống lá: Cắt ở 1/3 phía đáy cuống chừa phần sát chỗ nối cuống lá và thân.
- Phương pháp nhuộm vi phẫu:
+ Ngâm vi phẫu đã cắt trong nước javel đến khi mẫu trắng.
+ Rửa sạch vi phẫu bằng nước (3 – 4 lần).
+ Ngâm vi phẫu đã rửa vào dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút.
+ Rửa nước để loại bỏ hết acid acetic.
+ Nhuộm mẫu trong dung dịch thuốc nhuộm (đỏ son phèn – lục iod) khoảng 15 – 20 phút.
+ Rửa sạch vi phẫu bằng nước.
+ Ngâm trong nước thường hay trong dung dịch glyceryl 50%.
+ Lên tiêu bản và quan sát.
- Quan sát vi phẫu bằng kính hiển vi quang học. Mỗi bộ phận quan sát từ 5 - 10 lát cắt. Mô tả và chụp hình cấu trúc vi phẫu.
2.3.2. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu 2.3.2.1. Phương pháp chiết nguội
Hoạt chất từ 10 g mẫu dược liệu khô được chiết với 100 ml Ethanol 96% hoặc Ethanol 70% bằng phương pháp chiết nguội ở nhiệt độ phòng. Tiến hành chiết 03 lần:
lần đầu chiết 10 g dược liệu khô với 100 ml dung môi, phần bã dược liệu thu được tiếp tục chiết thêm 02 lần (mỗi lần chiết với 50 ml dung môi), bay hơi dung môi dịch chiết ở 500C, thu cao lỏng tỉ lệ 1:1 (1 g dược liệu/1 ml cao lỏng) (hình 2.1).
2.3.2.2. Phương pháp chiết nóng
Hoạt chất từ 10 g mẫu dược liệu khô được chiết với 100 ml EtOH 96% hoặc EtOH 70% bằng phương pháp chiết nóng trên bếp cách thủy ở 700C. Tiến hành chiết 03 lần: lần đầu chiết 10 g dược liệu khô với 100 ml dung môi, phần bã dược liệu thu được tiếp tục chiết thêm 02 lần (mỗi lần chiết với 50 ml dung môi), bay hơi dung môi dịch chiết ở 500C, thu cao lỏng tỉ lệ 1:1 (1 g dược liệu/1 ml cao lỏng) (hình 2.2).
Mẫu dược liệu khô
Cao lỏng 1:1
(1 g dược liệu/1 ml cao lỏng) Dịch chiết cồn
Ethanol 96% hoặc 70%
Ngâm 24 giờ, lọc Chiết 03 lần
(Dược liệu/dung môi: 1g/10ml)
Bay hơi ở 500C
Hình 2.1. Phương pháp chiết nguội
2.3.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn
Nguyên tắc: dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất trong dược liệu để tách thành các phân đoạn bằng dãy dung môi có độ phân cực tăng dần.
Chọn mẫu dược liệu cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất để tiến hành tách phân đoạn theo hình 2.3. Các phân đoạn sau khi tách được dùng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ.
Mẫu dược liệu khô
Cao lỏng 1:1
(1 g dược liệu/1 ml cao lỏng) Dịch chiết cồn
Ethanol 96% hoặc 70%
Chiết 03 lần ở 700C
(Dược liệu/dung môi: 1g/10ml)
Bay hơi ở 500C
Hình 2.2. Phương pháp chiết nóng
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán: vi sinh vật thử nghiệm được trải trên đĩa thạch chứa môi trường phù hợp, chất thử ở dạng dung dịch được cho vào các lỗ đục trên bản thạch. Sự khuếch tán của chất thử ra đĩa thạch ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật tạo thành vòng ức chế. Đường kính của vòng ức chế này tỉ lệ với hoạt lực kháng vi sinh vật.
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: vi khuẩn khảo sát được phân lập trên môi trường TSA, ủ ở 37 0C trong 18 – 24 giờ. Hoạt hóa vi khuẩn bằng cách lấy 3 - 5 khóm khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB, ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 0C. Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng môi trường TSB sao cho mật độ thu được tương đương OD600 ~ 0,08 – 0,1 (108 CFU/ml). Tiếp tục pha loãng vi khuẩn bằng môi trường TSB đến khi mật độ vi khuẩn đạt (106 CFU/ml). Vi khuẩn đã chuẩn bị được sử dụng trong vòng 15 phút.
Dịch chiết cồn n - hexan
Etyl acetat
Dịch chiết Etyl acetat
Dịch chiết cồn Dịch chiết cồn 96%
Dịch chiết n - hexan
Thử hoạt tính kháng khuẩn Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn
Chuẩn bị huyền dịch vi nấm: vi nấm C.albicans được phân lập trên môi trường SDA, ủ ở 37 0C trong 48 giờ. Chọn 1 – 2 khóm vi nấm phân tán trực tiếp vào nước muối sinh lí vô trùng. Chỉnh độ đục vi nấm sao cho mật độ thu được tương đương OD530 là 0,08 – 0,1 (106 CFU/ml)
Chuẩn bị đĩa thạch chứa vi sinh vật: mỗi đĩa Petri cho 20 ml môi trường MHA đối với vi khuẩn, môi trường SDA đối với vi nấm vào hộp Petri có đường kính 90 mm.
Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn, trải đều trên mặt thạch. Để hộp trong tủ ấm 3 – 5 phút để khô măt thạch. Đục lỗ bằng ống đục lỗ inox có đường kớnh 6 mm dạng chữ T đó tiệt trựng. Cho 50 àl chất thử vào cỏc lỗ đục trờn đĩa thạch đã trải vi sinh vật thử nghiệm tương ứng. Mỗi thử nghiệm được tiến hành lập lại 03 lần và lấy giá trị trung bình để xác định đường kính vòng ức chế.
Mẫu chứng: chứng dương dùng đĩa giấy tẩm kháng sinh chuẩn (Ciprofloxacin 5 àl, Vancomycin 30 àl), chứng õm dựng dung dịch cồn 10%.
Đọc kết quả: dùng thước đo có độ chia đến milimet đo đường kính vùng ức chế.
*Sử dụng phần mềm “Statistical Product and Services Solutions” (SPSS) phiên bản 11.5 dùng cho Windows để xử lí các số liệu thực nghiệm thu được, từ đó đánh giá kết quả của các thí nghiệm.
2.3.5. Phương pháp xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật
MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật quan sát bằng mắt thường. Vì cao chiết có khả năng tạo kết tủa nên sử dụng phương pháp pha loãng trên đĩa thạch sẽ cho kết quả chính xác hơn.
Chuẩn bị dung dịch mẹ: chất thử được cân chính xác và pha với DMSO thành dung dịch mẹ có nồng độ gấp 10 lần nồng độ cao nhất trong dãy. Dung dịch mẹ phải được bảo quản lạnh trước khi dùng.
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách lấy từ 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB, ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 0C. Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng môi trường TSB sao cho mật độ thu được tương đương OD600 là 0,08 – 0,1 (khoảng 108 CFU/ml), pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ khoảng 107 vi khuẩn/ml.
Pha loãng trong môi trường rắn: môi trường được đun chảy rồi để nguội đến 45 – 50 0C, chất thử được pha loóng ẵ với Mueller-Hinton (MHB) theo dóy nồng độ từ cao đến thấp và cho vào đĩa mụi trường MHA. Chấm 1 àl huyền dịch vi khuẩn tương đương 104 CFU/ml lên các đĩa thạch có nồng độ chất thử khác nhau.
Kết quả được đọc bằng sự hiện diện hay không của khóm vi sinh vật.