Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết
Mẫu Lục bình tươi sau khi thu hái được phơi dưới bóng râm từ 7 – 10 ngày đến khi khối lượng không đổi, tỉ lệ khối lượng từng bộ phận được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỉ lệ khối lượng khô từng bộ phận của cây Lục bình Khối lượng khô (g) Tỉ lệ (%)
Lá 2,9625 50,42
Phát hoa 1,5114 25,73
Căn hành 1,4011 23,85
Toàn cây 5,8750 100
Mẫu dược liệu khô được chiết với Ethanol 96% bằng phương pháp chiết nguội, cô cạn dịch chiết thu được thành dạng cao lỏng (tỉ lệ 1:1). Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch, đường kính vòng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật càng lớn chứng tỏ cao chiết có hoạt tính càng mạnh
(bảng 3.2). Dịch chiết cồn 96% bằng phương pháp chiết nguội được đánh số từ 1 → 14, tương ứng với 14 mẫu là các bộ phận cây Lục bình. Mỗi thí nghiệm được lặp
lại 6 lần và xử lí thống kê bằng phần mềm SPSS.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao toàn phần Mẫu
thử
Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus MRSA S. faecalis E. coli P.
aeruginosa
C.
albicans
1 9 ± 0,1cd 9 ± 0,2abc 8 ± 0,1bc 8 ± 0,1b - -
2 9 ± 0,2cd 9 ± 0,2bbc 9 ± 0,2f - - -
3 12 ± 0,2e 12 ± 0,2f 11 ± 0,2e 10 ± 0f 10 ± 0,2d -
4 13 ± 0,1f 12,5 ± 0,3g 12 ± 0,1f 10 ± 0f - -
5 9 ± 0,1cd 9 ± 0,2abc 8 ± 0abc - - -
6 12 ± 0,1e 10,5 ± 0,3e 10 ± 0,2e 9 ± 0,2d 10 ± 0,2d -
7 10 ± 0,2d 9,5 ± 0,2d 9 ± 0,2d 9,5 ± 0,2e - -
8 8,5 ± 0,2ab - - - - -
9 8 ± 0,1a 9 ± 0,2abc - - - -
10 9 ± 0bc 9 ± 0,1bcd 8 ± 0,2c - 9 ± 0,2b -
11 9 ± 0,2cd 9,5 ± 0,2f 8,5 ± 0,2c 9 ± 0,2cd 10 ± 0,2c -
12 8 ± 0,2a 8 ± 0,2a - - - -
13 8,5 ± 0,2ab 9 ± 0,2cd 8 ± 0,2ab 7 ± 0,1a 8 ± 0,1a - 14 8,5 ± 0,2ab 8 ± 0,2ab 7,5 ± 0,2a 8 ± 0,2bc 9 ± 0,2c - Chứng
dương
31 ± 0,3g 20,5 ± 0,3h 20 ± 0,2g 34 ± 0,2g 31,5 ± 0,5e
K Chứng
âm
- - - - - -
Các số trung bình trong cột/hàng với các mẫu tự khác nhau có ý nghĩa ở mức 95%
(-) không có khả năng ức chế. K: không thực hiện. Chứng dương: Ciprofloxacin đối với S.
aureus, S. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, Vancomycin đối với MRSA. Chứng âm: Ethanol 10%.
Nhận xét:
Cao lỏng thu được từ các bộ phận của cây Lục bình hầu hết đều có hoạt tính kháng khuẩn đối với 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Dịch chiết cồn 96% ở tất cả các bộ phận của cây Lục bình không có khả năng kháng nấm C. albicans. Mặc dù đường kính vòng ức chế không lớn, từ 8 – 13 mm nhưng toàn bộ 14 mẫu chiết đều có hoạt tính kháng S. aureus và MRSA, ngoại trừ mẫu 8 (chiết từ toàn cây ở môi trường nước chảy) không tác động lên MRSA. Trong 14 mẫu, các dịch chiết từ mẫu có căn hành – mẫu 3, 4, 6 – đều cho tác động kháng khuẩn cao nhất trên cả 5 chủng vi khuẩn (đường kính vòng kháng khuẩn ≥ 10 mm). Có thể thấy căn hành là bộ phận chứa nhiều chất kháng khuẩn nhất của cây Lục bình. Lục bình thu hoạch từ môi trường nước đứng ở các ao đọng thuộc tỉnh Bình Dương (mẫu 1→ 7) có khả năng ức chế vi khuẩn cao hơn Lục bình thu từ môi trường nước chảy (mẫu 8 → 14), các đường kính vòng ức chế đều
≥ 9 mm ngoại trừ mẫu 1 có đường kính là 8 mm ở S. faecalis và E. coli. Có sự khác biệt nhưng không đáng kể giữa đường kính vòng ức chế của cây chưa ra hoa và cây đang ra hoa (mẫu 2, 3 so với 5, 6). Trong phát hoa cũng có chứa hoạt tính kháng khuẩn (mẫu 7, 13) nên mẫu toàn cây đang ra hoa (mẫu 4) có hoạt tính tốt hơn so với mẫu toàn cây chưa ra hoa (mẫu 1).
Kết quả của chứng dương trên các chủng vi khuẩn đều lớn hơn so với dịch chiết, bởi vì kháng sinh sử dụng làm chứng dương là những chất có độ tinh khiết, hàm lượng cao, đã và đang được sử dụng trong lâm sàng, ngoài ra có thể có khả năng khuếch tán tốt hơn so với dịch chiết thử nghiệm. Cao toàn phần thu được ở dạng thô, chưa được tinh chế, lẫn nhiều tạp chất, vì vậy độ tinh khiết của
Hình 3.20. Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S. aureus
Hình 3.21. Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S. faecalis
hoạt chất cũng như khả năng khuếch tán của cao dược liệu sẽ thấp hơn so với kháng sinh tẩm trên đĩa.
Dựa trên kết quả thống kê thu được ở bảng 3.2 cho thấy chúng ta có thể thu hoạch Lục bình thời điểm chưa ra hoa và sử dụng bộ phận căn hành; với Lục bình đang ra hoa có thể sử dụng toàn bộ cây. Việc thu mẫu nguyên cây sẽ đơn giản và hiệu quả kinh tế hơn so với việc chỉ lấy căn hành vì căn hành chỉ chiếm 23,85% tổng khối lượng khô toàn cây (bảng 3.1), nhưng đồng thời cây đang ra hoa (tháng 10 – 11) sẽ không thể thu hoạch thường xuyên như cây chưa ra hoa. Vì vậy, chúng tôi chọn mẫu dược liệu có căn hành của cây ở môi trường nước đứng để khảo sát 02 phương pháp chiết nóng ở 70 0C và chiết nguội ở nhiệt độ phòng với EtOH 96% và EtOH 70%.
Bảng 3.3. Tác động kháng khuẩn của cao EtOH từ căn hành với phương pháp chiết và dung môi khác nhau
Chủng vi khuẩn
Đường kính vòng ức chế (mm)
Chiết nóng với EtOH Chiết nguội với EtOH EtOH 96% EtOH 70% EtOH 96% EtOH 70%
S. aureus 13 - 12 -
MRSA 13 - 12 -
S. faecalis 11 - 10 -
E. coli 10 - 10 -
P. aeruginosa 10 - 10 -
(-): không có khả năng ức chế.
Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy với dung môi là EtOH 96%, dịch chiết thu được từ phương pháp chiết nóng có đường kính vòng ức chế lớn hơn (10 – 13 mm) so với phương pháp chiết nguội (10 – 12 mm) nhưng sự khác biệt này không quá lớn.
So với dịch chiết EtOH 96%, dịch chiết EtOH 70% từ các mẫu không có hoạt tính kháng khuẩn. Như vậy, các hợp chất có tính kháng khuẩn của Lục bình tan tốt trong dung môi EtOH 96%. Do EtOH 70% có hàm lượng nước cao hơn EtOH 96% nên các hợp chất có hoạt tính có thể là những chất phân cực yếu, có khả năng tan trong EtOH nhưng rất ít tan trong nước. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi lấy
nước làm dung môi hòa tan cao chiết từ Lục bình cũng cho kết quả kháng khuẩn thấp [13]. Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp chiết nóng với EtOH 96% để khảo sát cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao Lục bình sau khi chiết phân đoạn
Với mục đích thu được cao dược liệu có hàm lượng hoạt chất kháng khuẩn cao nhất, chúng tôi tiến hành chiết phân đoạn cao toàn phần với 02 dung môi có độ phân cực tăng dần là n – hexan và etyl acetat. Sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau có thể tách các hợp chất trong cao toàn phần dựa trên độ hòa tan của chúng trong hệ dung môi.
Bảng 3.4. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết từ căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước đứng
Phân đoạn Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus MRSA S. faecalis E. coli P. aeruginosa
n - hexan 0 0 0 0 0
Etyl acetat 11 11 10 9 10
Cồn 0 0 0 0 0
Bảng 3.5. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết toàn cây của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng
Phân đoạn Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus MRSA S. faecalis E. coli P. aeruginosa
n - hexan 0 0 0 0 0
Etyl acetat 11 11 11 9 10
Cồn 0 0 0 0 0
Nhận xét:
Kết quả cho thấy hoạt chất kháng khuẩn có trong Lục bình là chất tương đối phân cực vì tan hầu hết trong etyl acetat là một dung môi phân cực. Kết quả trên cũng cho
thấy các hợp chất kém phân cực của cây Lục bình trong phân đoạn n – hexan không có hoạt tính kháng khuẩn. Trong 03 phân đoạn chiết tách thì phân đoạn chiết bằng dung môi etyl acetat là phân đoạn duy nhất cho hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, tuy nhiên đường kính vùng ức chế lại có phần giảm so với dịch chiết toàn phần với EtOH 96%. Hiện tượng này có thể do một số chất kháng khuẩn vẫn có thể tan trong các phân đoạn khác nhưng với một lượng nhỏ nên không đủ thể hiện hoạt tính khi thử nghiệm. Vì vậy, cao toàn phần từ dung môi EtOH 96% sẽ được sử dụng để xác định MIC.