L ỜI MỞ ĐẦU 1.
2.2.1.1. Phân tích fucoidan
Fucoidan là một sulfate polysaccharide có chứa fucose, cấu trúc của fucoidan không rõ ràng, thành phần hóa học và cấu trúc fucoidan trong các loài rong khác nhau thì khác nhau. Trên một loài rong sử dụng các phương pháp chiết khác nhau thì thu được các fucoidan cũng có thành phần và cấu trúc khác nhau. Fucoidan tinh sạch chiết ra từ một loài rong bao gồm nhiều phân đoạn phân tử cũng như phân đoạn cấu trúc khác nhau, tách rời từng phân đoạn bằng các phương pháp hóa lý khác nhau, thu được các fucoidan có thành phần hóa học và cấu trúc phân tử rất khác nhau.
Vì vậy không có một chất chuẩn fucoidan cho tất cả các dạng fucoidan, thậm chí đối với fucoidan chiết ra từ 1 loài rong cũng không có chất chuẩn cho chính nó.
Với fucoidan từ rong nâu vùng ôn đới, thành phần của fucoidan từ chúng hầu như chỉ có đường fucose, các loại đường khác hàm lượng rất thấp, có thể coi như bỏ qua, vì vậy người ta thường xác định fucoidan bằng cách
fucoidan từ loài rong nào.
Ở Việt Nam, riêng Sargassum đã được liệt kê đến trên 72 loài Việt Nam là 1 trong 3 nước có phân bố số loài rong nâu lớn nhất trên thế giới. Đồng thời hàm lượng các đường khác như galactose, mannose, xylose, rhamnose, glucose và axít uronic rất lớn, thường có vài thành phần đường lớn hơn cả đường fucose. Mặc khác các loại đường hexose này phân bố không đồng đều trong phân tử vì vậy nếu chiết lấy các phân đoạn khác nhau thì thành phần đường fucose trong mỗi phân đoạn khác nhau và đương nhiên dẫn đến cấu trúc khác nhau. Từ đó cho thấy không thể nhân hệ số nào cho fucoidan từ rong nâu Việt Nam để xác định hàm lượng fucose.
Trước đây, một số nhà nghiên cứu đã tinh chế fucoidan, xác định hàm lượng fucose có trong fucoidan tinh chế, sau đó quay lại xác định hàm lượng fucose có trong mẫu fucoidan thô, từ đó tính ra lượng fucoidan có trong mẫu fucoidan thô. Người ta dùng phương pháp này vì lo ngại khi tinh chế một lượng lớn fucoidan sẽ mất đi do hiệu suất của phương pháp chiết, mẫu fucoidan tinh sạch lấy ra không cần tính đến hiệu suất miễn sao lấy được fucoidan sạch, sau đó lượng mẫu khác sẽ được thủy phân để so sánh fucose từ đó tính ra fucoidan.
Thực tế, phản ứng thủy phân fucoidan thành đường không xảy ra hoàn toàn được, không phải toàn bộ các đường có mặt trong polysaccharide sẽ có đủ trong dịch thủy phân. Đồng thời như đã nêu trên, fucose tách chiết hoặc tinh sạch bằng các phương pháp khác nhau thì thành phần và cấu trúc khác nhau, hoặc nếu thu được các phân đoạn khác nhau của cùng một fucoidan thì chúng cũng khác nhau. Rõ ràng fucoidan thô và fucoidan tinh được thu bằng 2 phương pháp tách chiết và tinh sạch khác nhau nên không thể đem hàm lượng fucose của sản phẩm này tính cho sản phẩm khác).
Cũng trong công bố này, nhóm sulfate trong từng phân đoạn khác nhau có vị trí trong gốc đường là khác nhau nên phổ hồng ngoại thu được có đỉnh hấp thụ sulfate cũng khác nhau. Các đường khác hoặc các nhóm chức khác cũng thay đổi như vậy. Do đó không đem cường hấp thụ một nhóm chức nào
đó trong phân đoạn fucoidan này so với fucoidan khác hoặc tinh so với thô hoặc fucoidan từ loài rong này này với fucoidan từ loài rong khác.
Cuối cùng, một phương pháp đơn giản nhất, chấp nhận một sự mất mát nhỏ bằng một chuổi phản ứng xảy ra hoàn toàn (tạo kết tủa). Hàm lượng fucoidan được tính bằng fucoidan tinh chế chia trên khối lượng mẫu lấy ban đầu.
Nhiều phương pháp khác nhau được dùng để tinh chế fucoidan trên thế giới từ rất phức tạp đến rất đơn giản. Nhưng sẽ không chính xác khi áp dụng cho fucoidan từ rong nâu Việt Nam từ đặc thù cấu trúc đã nêu trên của nó vì trong phân tử fucoidan của Việt nam luôn luôn chứa uronic axít và đầy đủ các loại đường khác.
Một trong những phương pháp dễ thực hiện nhất đó là phương pháp theo công bố "Efects of Fucoidan from Mozuku on Human Stomach Cell Lines" Food Sci. Technol. Res.12 (3) 218-222, 2006.
Kỹ thuật chủ yếu của phương pháp này có thể diễn đạt như sau:
Fucoidan tác dụng với một nhựa trao đổi ion dạng lỏng tạo thành kết tủa (trong bài dùng cetyltrimethylammonium bromide: CTAB, đây là một dịch, có thể thay bằng các hợp chất cùng loại khác như benzalkonium chloride: BKC, cethypiridium chloride..). Để khỏi mất mẫu, trước khi tạo kết tủa phải rử sạch muối bằng cách thẩm tách hoặc lọc rây phân tử. Muối có mặt trong dung dịch sẽ rửa giải fucoidan ra khỏi nhựa lỏng, hay nói cách khác một lượng fucoidan sẽ không kết tủa ứng với một nồng độ muối xác định trong dung dịch.
Rửa sạch kết tủa bằng nước cất, các chất khác như 1-3beta gulucan..polyphenol sẽ tan trong dịch và bị loại.
Muối sẽ được đưa vào để rửa giải fucoidan tan ra dung dịch. Tuy nhiên, đưa nước vào sẽ làm kết tủa lơ lửng, nhầy rất khó thu nhận.
Ethanol có tác dụng kết tủa fucoidan, muối được trộn trong ethanol sẽ đẩy fucoidan ra, nhựa lỏng tan vào ethanol và ethanol làm kết tủa fucoidan
không có nhựa, tức là kết tủa fucoidan-nhựa lỏng sẽ trở thành kết tủa fucoidan trong ethanol, còn nhựa tan vào dịch ethanol+muối.
Rửa kết tủa nhiều lần bằng ethanol 85% (v/v) để hòa tan hết muối và nhựa lỏng còn dính trong fucoidan. lần cuối cùng dùng ethanol tuyệt đối hoặc aceton để rửa, nước bị hút hết vào ethanol, fucoidan được đem sấy khô thu được fucoidan tinh sạch. Tính tỉ lệ fucoidan tinh trên lượng mẫu đó là hàm lượng fucoidan của mẫu. Chấp nhận các mất mát fucoidan trong quá trinh tinh sạch nhưng đó là kết quả nghiêm ngặt nhất trong các phương pháp (người ta có thể đưa ra phương pháp sử dụng HPLC, HPEAC, IR.. hoặc các loại công cụ rất mạnh khác để xác định fucose trong fucoisan tinh chế được, sau đó so với fucose trong mẫu để tính hàm lượng fucoidan, các phương pháp này như đã phân tích trên, nguồn gốc lý luận của nó thực tế chưa dùng.