Hiện nay, rất nhiều loại tế bào đã được sử dụng để tạo dòng iPSC thành công [9]. Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình như: tế bào đơn nhân máu ngoại vi (Peripheral blood mononuclear cell - PBMC), nguyên bào sợi (Fibroblast), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell), tế bào gốc tủy răng sữa (Dental pulp stem cells), tế bào gốc dây rốn (Cord blood cells), tế bào gan (hepatocytes), tế bào nước ối (Amniotic fluid cells), tế bào mầm sinh dục (Germline stem cell).
Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình tế bào gốc vạn năng cảm ứng được thể hiện tại hình 2.10.
Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC
Có nhiều nguồn thu nhận tế bào gốc vạn năng cảm ứng như nguyên bào sợi, máu cuống rốn, máu ngoại vi. Nguyên bào sợi là một nguồn chủ yếu để tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng với khả năng tăng sinh qua nhiều lần cấy chuyển trong nuôi cấy, và khả năng tiếp nhận hiệu quả các virus biểu hiện tổ hợp các yếu tố phiên mã cho tái lập trình [8]. Tuy nhiên, nguyên bào sợi sinh thiết từ da đòi hỏi các thủ thuật xâm lấn, tốn nhiều công sức và lấy đủ số lượng tế bào để tái lập trình cần có thời
19
gian. Ngoài ra, khả năng tạo iPSC từ da có tương quan nghịch với tuổi của người hiến tặng do khả năng gây đột biến bên ngoài lớp da [12].
Cuống rốn là một bộ phận giúp cung cấp dinh dưỡng nuôi thai nhờ sự kết nối thai nhi với nhau thai trong tử cung người mẹ. Máu cuống rốn là máu được lấy từ cuống rốn và nhau thai sau khi sinh con và cắt rốn. Trước đây, cuống rốn và nhau thai thường được bỏ đi sau mỗi ca sinh nở như một loại rác thải y tế. Tuy nhiên, thực tế máu cuống rốn là nguồn cung cấp dồi dào tế bào gốc tạo máu. Lấy máu cuống rốn được xem là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không gây đau cho cả mẹ và bé, có thể áp dụng cho cả sinh mổ và sinh thường. Trong máu cuống rốn chứa một lượng lớn tế bào gốc tạo máu có khả năng tái tạo các tế bào máu và tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể.
Việc tái lập trình các tế bào CD34+ trong máu cuống rốn thành các tế bào gốc vạn năng cảm ứng có các ứng dụng tiềm năng trong y học tái tạo bằng cách chuyển đổi các ngân hàng máu cuống rốn thành ngân hàng iPSC để điều trị thay thế tế bào dị ghép [49]. Tế bào CD34+ từ máu ngoại vi cũng đã tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng [49]
Một trong những dấu hiệu để nhận biết tế bào tạo máu (hematopoietic) là protein bám màng (marker) - CD34. Nhiều dòng iPSC ở người được tạo ra từ máu dây rốn đông lạnh từ tế bào CD34+ của các bệnh nhân khỏe mạnh và có thể được chuyển hướng đến biệt hóa tạo máu [52]. CD34 được biểu hiện trên bề mặt tế bào tủy xương ở người từ 1-5%, máu cuống rốn là ~1% và <0,1% từ máu ngoại vi [55].
Mặc dù CD34 được biểu hiện với cường độ cao ở tế bào tủy xương, nhưng việc lấy tế bào gốc tủy xương cần thủ thuật xâm lấn gây ra những tác dụng phụ không mong muốn cho bệnh nhân, vì thế trong thí nghiệm này tôi đã sử dụng tế bào CD34 được phân lập từ máu cuống rốn.
Tế bào sinh dưỡng phải được biểu hiện các gene của tế bào gốc để tạo thành iPSC. Hiện nay có nhiều biện pháp khác nhau để tế bào biểu hiện những gene mong muốn như: lentivirus, excisable lentivirus, RNA, transposon, episomal vector, các phân tử nhỏ (Small molecule, ví dụ: mi RNA), Protein. Lentivirus chèn vào hệ gene
20
của tế bào nhận vì thế iPSC rất dễ bị thay đổi kiểu nhân, và lo ngại gây ra khối u khi sử dụng iPSC trong liệu pháp tế bào. Tạo iPSC bằng protein có độ an toàn rất cao nhưng hiệu quả lại thấp. Sử dụng mRNA có tính an toàn cao nhưng cần nhiều thời gian để thao tác và hiệu suất thành công không cao. Episomal vector là một phương pháp chuyển gene mà không chèn vào hệ gene của tế bào đích. Episomal vector là vector DNA tồn tại trong nhân tế bào và có khả năng tự tái bản độc lập với DNA của tế bào đích [41]. Các yếu tố tái lập trình có thể chuyển vào tế bào sinh dưỡng bằng cách sử dụng episomal vector như plasmid hoặc DNA nhỏ dạng vòng (minicircle DNA). Không như retrovirus và lentivirus, phương pháp này đơn giản hơn, dễ tiến hành và gây biến đổi hệ gene của tế bào đích. Bên cạnh đó, RNA, transposon, các phân tử nhỏ (Small molecule) là các phương pháp tạo iPSC mà không tác động đến hệ gene của tế bào chủ nhưng lại có những nhược điểm như:
thời gian tiến hành thí nghiệm lâu hơn, hiệu suất thấp hơn, tỉ lệ thành công không cao, chi phí đắt [51]. Chính vì thế chúng tôi đã sử dụng Episomal vector với tính an toàn cao, giá thành rẻ, hiệu quả tốt và thời gian thao tác thí nghiệm nhanh [3]. Tuy nhiên, biểu hiện của episomal không kéo dài, nên hiệu quả tái lập trình của nó thấp khi so sánh với minicircle DNA.
Các phương pháp biểu hiện gen được trình bày ở hình 2.11.
Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình
21
Phần 3