Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài 3.3.2.2. Các phương pháp sử dụng trong đề tài
3.3.2.2.1 Tế bào gốc tạo máu CD34+ trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (CD34+ 80%)
Tế bào CD34 trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (80% tế bào dương tính với marker tế bào gốc tạo máu CD34+ sau khi tinh sạch bằng cột) được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec
26
3.3.2.2.2. Rã đông và nuôi tăng sinh tế bào CD34+ a. Chuẩn bị:
Làm ấm môi trường cơ bản nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu (StemSpan-ACF) và rã đông ống chứa hỗn hợp các cytokine bổ sung (StemSpan CC110)
Tế bào gốc tạo máu trữ đông Đĩa 6 giếng
b. Quy trình nuôi tăng sinh
- Pha môi trường nuôi cấy tế bào bằng cách trộn đều StemSpan-ACF với StemSpan CC110 với tỉ lệ phù hợp
- Cho 2 ml vào đĩa 6 giếng. Để vào tủ ấm.
- Lấy ống tế bào trữ đông ra khỏi tủ -800C, làm ấm nhanh để dịch chứa tế bào tan ra.
- Hút hết dịch tế bào cho vào ống falcon 15ml chứa môi trường đã ủ ấm - Ly tâm falcon tế bào 400G/4 phút và đổ bỏ dịch nổi
- Hòa lại cặn tế bào trong 1ml môi trường và hút vào giếng có chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn
- Hút môi trường ở đĩa 6 giếng vào ống eppendorf 2 ml. Trộn nhẹ
- Cho vào đĩa 6 giếng/ lắc nhẹ sau đó để vào tủ ấm 370, nồng độ CO2 5%.
c. Phương pháp thay môi trường tế bào
Trong quá trình nuôi tăng sinh tế bào, khi mật độ tế bào phủ trên đĩa nuôi cấy 70-80% (sau khoảng 24-48 giờ), môi trường cũ được thay bằng môi trường mới để cung cấp dinh dưỡng cho tế bào phát triển.
Quy trình bổ sung môi trường trong quá trình nuôi cấy:
- Hút bỏ môi trường cũ.
- Thêm môi trường mới.
- Huyền phù và nuôi tiếp.
d. Phương pháp cấy chuyển tế bào
27
Khi tế bào đạt mật độ 70-80% bề mặt diện tích bình nuôi, tế bào được cấy chuyển để tạo không gian cho tế bào phát triển và tăng sinh.
Quy trình cấy chuyển - Hút hết môi trường cũ.
- Ly tâm 3000 vòng/ 5 phút loại môi trường.
- Huyền phù lại cặn tế bào trong môi trường mới và nuôi tiếp.
e. Phương pháp xác định tế bào sống chết bằng thuốc nhuộm Trypan Blue - Hỳt 10 àl dung dịch tế bào, thờm vào 10 àl dung dịch Trypan Blue, trộn đều bằng micropipette.
- Hút dịch đã trộn nạp vào buồng đếm hồng cầu.
- Đếm tế bào ở 4 vùng 16 ô ở 4 góc của buồng đếm, tính mật độ tế bào theo công thức:
Số tế bào = 𝑠ố đế𝑚
4 x độ pha loãng x 104
3.3.2.2.3. Phân tích tỷ lệ tế bào CD34+ trong quần thể tế bào tăng sinh bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry)
“Cytometer” là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “κντοζ” nghĩa là cơ thể (theo nghĩa hiện đại tức là tế bào), và “μετρον” mang nghĩa đo đạc. Phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật phổ biến trong tế bào học dùng để đánh giá các đặc điểm của tế bào như: đếm số lượng tế bào, đo kích thước, đánh giá độ phức tạp bên trong tế bào, phát hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào khi được nhuộm huỳnh quang. Khi dòng chảy đơn bào đi qua chùm laser, máy thu được hai loại ánh sáng là tán xạ trước (forward scatter – FC) và ánh sáng tán xạ ngang (side scatter – SC). FC dùng để xác định kích thước của tế bào; SC dùng để xác định độ phức tạp bên trong tế bào và phát hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào qua ánh sáng huỳnh quang [52].
Chuẩn bị:
Quy trình chuẩn bị ống và kháng thể chạy trong Flow cytometry:
- Tế bào được ly tâm 3000 G/5 phút thu cặn - Huyền phù lại cặn tế bào trong 150 ul PBS
28
- Bổ sung kháng thể - Ủ tối 20 phút
- Bật máy phân tích dòng chảy tế bào - Rửa lại máy bằng nước sạch
- Vontex ống trước khi đặt vào máy phân tích dòng chảy tế bào - Chạy mẫu cần phân tích
Thiết kế thí nghiệm được trình bày bảng 3.4:
Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry
Sau đó, kết quả được phân tích bằng phần mềm FlowJo.
3.3.2.2.4. Chuyển các vector chứa các nhân tố phiên mã cảm ứng tái lập trình vào tế bào CD34+ bằng phương pháp Nucleofector
Nhận vector từ Yamanaka (Nhật Bản)
Hai vector pCEB-hUL-G và pECB-hSK-O đã được thử nghiệm lâm sàng trên bệnh thoái hóa điểm vàng do tuổi tác [51], chính vì thế mà nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã liên hệ với Yamanaka để mua 2 vector trên.
Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình Ống 1
(ống đối chứng)
Ống 2 (CD45/CD34)
Ống 3 (CD45/IsoClonic
Control - PE)
CD45-FITC/CD34-PE X 10 ul X
CD45-FICT/IsoClonic
Control-PE X X
10 ul
7-AAD X 10 ul 10 ul
105 tế bào/ống 50 ul 50 ul 50 ul
29
Các thành phần của vector pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O, vai trò và chức năng của chúng được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O
Thành phần Mục đích
OriP Điểm khởi đầu sao chép
CAG Promoter thúc đẩy mức độ biểu hiện gen cao trong các vector biểu hiện
WPRE Vector WPRE làm tăng biểu hiện gen từ vector retroviral CoIE1 ori Điểm khởi đầu sao chép có nguồn gốc từ vi khuẩn
Ampr Gene kháng kháng sinh
loxP Thông qua việc định hướng của cặp loxP cho phép gen được kích hoạt, trao đổi và ức chế các gen khác
pA Đuôi polyA-bảo vệ m RNA khỏi tác dụng của nuclease trong tế bào chất
EBNA-1 Protein liên kết trực tiếp với DNA và có một phần thì bám vào chuỗi xoắn vòng xoắn của DNA
hGLIS1 Protein ngón tay kẽm (zinc finger protein) có chức năng như một chất kích hoạt và ức chế phiên mã
hLin28 Yếu tố thúc đẩy tính đa năng
hL-MYC Làm cho chất bị nhiễm sắc tạo ra để tạo thành các chỗ cho các protein khác gắn vào
hSOX2 Phục hồi chức năng của tế bào, giúp cho tế bào bình thường biểu hiện protein quan trọng cho tính gốc của tế bào, kích thích sự biểu hiện của chính nó để tạo ra nhiều protein SOX2 và OCT3/4 hơn OCT3/4
hKLF4 Kìm hãm sự chết có chương trình a. Biến nạp
Có hai phương pháp để biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào khả biến đó là xung điện và shock nhiệt. Xung điện có ưu điểm hơn shock nhiệt là có hiệu suất biến nạp cao, tuy nhiên lại có nhược điểm làm chết nhiều tế bào. Tôi thực hiện quá trình biến nạp plasmid dùng để tái lập trình vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt.
- Tế bào khả biến (Competent cell) ( 3 ống) ở tủ -80cho vào khay đá - Plasmid : PGEF (1 àg) vào ống tế bào khả biến (đối chứng)
SK- O (3 àg) vào ống tế bào khả biến
30
UL- G (5 àg) vào ống tế bào khả biến - Hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 420/45 giây - Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá
- Bổ sung 400 àg mụi trường LB (khụng cú khỏng sinh). Hỗn hợp được nuụi ở 370/ lắc 170 vòng/phút trong vòng 1 giờ.
- Sử dụng que cấy trải vụ trựng trải 200 àl dịch khuẩn lờn đĩa mụi trường LB có agar (imMedia TM Amp Liquid for AmpR recombinant E. coli strains). Ủ đĩa peptri ở 370 qua đêm.
Sau khi nuôi qua đêm ở 37 oC, thu được khuẩn lạc. Chọn một khuẩn lạc phát triển nhanh nhất để nuôi tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid.
b. Tách plasmid
Tiến hành tách chiết plasmid dựa trên nguyên lí của việc biến tính bằng kiềm đối với DNA plasmid và DNA nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc DNA plasmid sau khi trung hòa dung dịch.
Cách tiến hành:
Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprepR Spin Miniprep của QIAGEN.
- Ly tâm 6000 vòng/5 phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 250 àl Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống eppendorf mới.
- Bổ sung 300 àl vào mỗi ống eppendorf.
- Bổ sung 250 àl Buffer P2 vào mỗi ống, đảo ống 4-5 lần.
- Bổ sung 350 àl Buffer N3/ lắc nhẹ - Ly tâm 15.000 vòng/10 phút/ 16 o - Thu dịch nổi cho vào cột
- Ly tâm 15.000 vòng/1 phút/ loại dịch đi qua cột
- Lấy 2 ống epppendorf còn lại thu dịch nổi, bỏ tiếp lên 2 cột tương ứng - Ly tâm 15.000 vòng/1 phút sau đó loại bỏ dịch đi qua cột
31
- Bổ sung 750 àl Buffer PB. Ly tõm 15.000 vũng/1 phỳt. Đổ dịch qua cột - Chuyển 2 cột sang 2 eppendorf sạch
- Cho 50 àl Elusion Buffer, để nhiệt độ phũng 5 phỳt - Ly tâm 15.000 vòng/5 phút
- Bỏ cột, bổ sung 50 àl Elusion Buffer bảo quản 2 eppendorf chứa mẫu
Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprepR Spin Maxiprep của hãng QIAGEN
- Ly tâm 6000 G/15 phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 10 ml Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống eppendorf mới.
- Bổ sung 10 ml Buffer P2, đảo ống 4-5 lần.
- Bổ sung 350 àl Buffer P3/ lắc nhẹ. Để ở tủ 4 o /20 phỳt - Ly tâm 11.000G/30 phút/ 4 o Hút dịch trong
- Ly tâm 11.000G/30 phút/4 o. Thu dịch nổi - Cho 10 ml Buffer QBT vào cột để rửa cột - Thu dịch nổi cho vào cột. Bỏ dịch, giữ lại cột - Bổ sung 60 ml Buffer QC. Giữ cột, thay ống mới - Bổ sung 15 ml Buffer QF
- Bổ sung 10,5 ml isopropanol. Trộn nhẹ
- Ly tâm 11.000 G/30 phút/ loại dịch đi qua cột - Rửa bằng 5 ml cồn 70 o. Ly tâm 11.000G/10 phút - Bổ sung 500 àl Nuclease Free Water và bảo quản mẫu.
Phương pháp định tính, định lượng DNA
Phương pháp định lượng DNA bằng máy quang phổ.
Sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop 2000 để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA sau khi tách chiết ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm.
Nguyên lý: Máy kiểm tra độ tinh sạch NanoDrop 2000 hoạt động dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purine và
32
pyrimidine. Giá trị mật độ quang phổ ở bước sóng 260 nm của các mẫu đó cho phép xác định nồng độ ADN trong các mẫu dựa vào mối tương quan sau:
- Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, đo giá trị OD ở bước sóng 280. OD280là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 như các phân tử acid nucleic do đó
có thể làm sai lệch giá trị nồng độ thật của acid nucleic.
- Để đảm bảo chính xác nồng độ CDNA người ta sử dụng giá trị A260/280.
Khi giá trị A260/280 =1,8 – 2,0 dịch chiết DNA được coi là tinh sạch [54].
Phương pháp điện di agarose.
Phương pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử
tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
Chuẩn bị gel
- Cân 0,5 gam agarose cho vào 50 ml dung dịch TBE 0,5X, đun sôi trong lò vi sóng sao cho agarose tan hoàn toàn.
- Để gel nguội đến 60 oC, cho 2,5 àl Redsafe. Đổ hỗn hợp vào khuụn đó cài sẵn lược và đợi cho gel đông lại.
- Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.
- Đổ dung dịch đệm TBE vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Tra mẫu điện di
- Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 2,5 àl mẫu, 1,5 àl ladder 1 àl Green Buffer
- Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 135 V trong 30 phút (khi vị trí vạch màu chạy được khoảng 2/3 bản gel).
33
- Kiểm tra gel bằng máy chụp ảnh gel Bio-Rad.
c. Phương pháp xung điện
Phương pháp xung điện hay còn được gọi là điện biến nạp (electroporation).
Phương pháp xung điện là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử
DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.
Xung điện theo quy trình Lonza Nucleofector
- Chuẩn bị đĩa 6 giếng bằng cách đổ đầy số lượng giếng thích hợp với 1,5 ml môi trường nuôi cấy bổ sung vào đĩa trước khi ủ trong tủ ấm 370/5% CO2.
- Đếm tế bào và xác định mật độ tế bào.
- Ly tâm ở 200G/10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần nổi thu cặn.
- Để cặn cẩn thận trong dung dịch Nucleofection.
- Cho 100 àl tế bào với 1 àg DNA.
- Chuyển tế bào/ DNA vào cuvette.
Chạy máy chuyển gen 4D-Nucleofactor.
Thờm 500 àl mụi trường nuụi cấy vào cuvette một cỏch nhẹ nhàng sau đó
chuyển sang đĩa 6 giếng (đã phủ bề mặt nuôi cấy với cơ chất với tỷ lệ CELLstart 1:50 PBS)
3.3.2.2.5. Cảm ứng tái lập trình bằng cách chuyển đổi từ từ môi trường chuyên biệt Môi trường chuyên biệt: iPS Brew XF 50X Supplement và iPS Brew XF được trộn đều. Bảo quản môi trường ở nhiệt độ 4℃ có thể sử dụng được 2 tuần, - 20℃ có thể sử dụng được trong 1 tháng.
3.3.2.2.6. Thu một phần tế bào để kiểm tra hiệu suất chuyển gen bằng phương pháp Real time PCR
3.3.2.2.6.1 Tách RNA
RNeasy Mini là bộ kit tách RNA tổng số trên vi khuẩn có chứa Guanidine isothiocyanate để làm bất hoạt RNase, được sử dụng cho hầu hết các phương pháp
34
ly giải ban đầu khác nhau. Ethanol sau đó được thêm vào lysate để RNA liên kết với màng silica-gel của các cột. Lysate sau đó được thêm vào cột và ly tâm. RNA liên kết với cột được rửa với đệm thứ nhất và hai lần đệm thứ hai, một lần nữa ly tâm loại bỏ dịch nổi. Cuối cùng RNA được rửa bằng cách thêm nước không có Rnase [55].
Phương pháp tách RNA theo bộ kit của QIAGEN - Ly tâm 2000 vòng/ 10 phút thu cặn tế bào.
- Pha 1 ml RLT buffer + 10 àl B – mercaptoehanol. Thờm 350 àl hỗn hợp rồi vontex kỹ.
- Ly tâm 15.000 vòng/ 3 phút.
- Cho 350 àl dung dịch sang ống mới. Bổ sung 350 àl cồn 700. Trộn đều và cho qua cột.
- Ly tâm 15.000 vòng/15 giây.
- Bỏ dịch dưới cột. Giữ cột.
- Thờm 700 àl Buffer RW1. Ly tõm 15.000 vũng/15 giõy. Bỏ dịch ở dưới cột.
- Bổ sung 500 àl RPE buffer.
- Ly tâm 15.000 vòng/2 phút. Bỏ dịch ở dưới cột.
- Ly tâm 15.000 vòng/10 giây. Bỏ dịch.
- Bổ sung 30 àl RNase – free water. Ly tõm 15.000 vũng/1 phỳt sau đó đi kiểm tra nồng độ RNA và độ tinh sạch bằng máy đo nồng độ NanoDrop 2000.
Mức độ tinh sạch của RNA được xác định bằng giá trị A260/280. Khi giá trị A260/280 =1,8 – 2,1 dịch chiết RNA được coi là tinh sạch [59].
3.3.2.2.6.2 Phương pháp Realtime quantitive RT-PCR 3.3.2.2.6.2.1 Enzyme phiên mã ngược
Giai đoạn phiên mã ngược (reverse transcription – RT) là một giai đoạn hết sức quan trọng quyết định sự thành công của real time PCR. Enzyme được sử dụng trong giai đoạn này là Reverse transcriptase được tách chiết từ Moloney murien leukemia virus (M-MLV) gây bệnh ung thư bạch cầu trên chuột, hay từ Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung thư tủy trên gia cầm. Enzyme reverse
35
transcriptase là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (complementary DNA – cDNA), do vậy giai đoạn phiên mã ngược còn được gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA.
Để enzyme reverse transcriptase có thể tổng hợp được cDNA từ sợi khuôn là mạch đơn RNA, cần phải có mồi đặc hiệu bám lên trên sợi khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme reverse trancriptase khi trượt lên mạch khuôn RNA có thể kéo dài được mạch cDNA.
Các thành phần để kết hợp phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
50 ng/ àl random hexamers 1 àl
10 mM dNTP mix (10 mM each) 1 àl
mRNA Up to 11 àl
H20 To 13 àl
Các hỗn hợp trên được ủ 650 trong 5 phút, sau đó hỗn hợp được ủ trên đá 1 phút.
Các thành phần tổng hợp cDNA được trình bày tại bảng 3.7.
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
5X SSIV Buffer 4 àl
100 mM DTT 1 àl
Ribonuclease Inhibitor 1 àl
SuperScript™ IV Reverse Transcriptase (200 U/ àl) 1 àl
Thành phần kết hợp phản ứng PCR (bảng 3.6) và các thành phần tổng hợp cDNA (bảng 3.7) được trộn đều và cài chu trình nhiệt PCR cDNA như hình 3.3 và chạy máy PCR Proflex 3 block.
36
Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA
Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng Real time PCR.
3.3.2.2.6.2.2. Real time PCR sử dụng SYBR Green phát hiện và định lượng tế bào chuyển gen.
Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR), nhằm khuếch đại và cùng lúc định lượng được số lượng của phân tử DNA mong muốn. Áp dụng kỹ thuật Real time PCR người dùng không cần thiết phải thực hiện thao tác điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để xác định sản phẩm sau khuếch đại. Kỹ thuật Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành. SYBR Green là nguyên nhân phát huỳnh quang, có thể liên kết với mạch đôi DNA và phát huỳnh quang với cường độ mạnh mẽ hơn dạng tự do trong dung dịch. Do đó, quá trình nhân bản DNA thể hiện trực tiếp trên máy luân nhiệt qua từng chu kỳ. Tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ tỉ lệ với lượng sản phẩm tạo thành qua mỗi chu kỳ đó [57].