Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2
Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau 2 ngày nuôi tăng sinh
Ở hình 4.5, chúng ta có thể thấy tế bào sau khi rã đông và cho vào môi trường nuôi tăng sinh thì sau 2 ngày, tất cả tế bào quan sát được đều có hình dạng tròn, sáng, là các đặc điểm điển hình của tế bào gốc tạo máu trong điều kiện nuôi cấy huyền phù, mật độ tế bào đạt khoảng 10-20% bề mặt đĩa nuôi cấy.
Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau 5 ngày nuôi tăng sinh
44
Sau 5 ngày nuôi cấy (hình 4.6) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ tế bào bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Kết quả đếm số lượng tế bào cho thấy tổng số lượng tế bào đạt được là 1,57 x 106 tế bào. Trong đó, khoảng 1 triệu tế bào được trữ đông trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide) và 7,5 % BSA (Bovine serum albumin). 2,7 x 105 tế bào được sử dụng để nuôi cấy tiếp trong đĩa 6 giếng với thời gian 3 ngày với mục đích đạt số lượng tế bào để điện biến nạp. Khoảng 3 x 105 tế bào cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm tế bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry) để kiểm tra. Tác dụng của các kháng thể như sau.
Kháng nguyên CD34 thuộc họ glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng, biểu hiện hầu như tất cả trên các tế bào tiền thân tạo máu bao gồm cả tế bào gốc đa năng.
Kháng thể CD45 nhận diện các kháng nguyên CD45 trên bề mặt các tế bào bạch cầu với trọng lượng phân tử 180, 190, 210 và 220 KD. Nó còn được gọi là kháng nguyên bạch cầu chung (leukocyte common antigen – LCA) được biểu hiện trên mọi loại tế bào tạo máu ngoại trừ hồng cầu trưởng thành và các tế bào tiền thân của chúng.
Thuốc nhuộm 7AAD là một đồng phân của Actinomycin D có chứa một nhóm amino thay thế ở vị trí 7 của chromophore. Các tế bào chết là nguồn gây nhiễu trong phân tích các tế bào bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy. Các tế bào chết sẽ được đánh giá và phân biệt bằng cách bắt màu nhuộm 7AAD trong khi các tế bào sống thì không.
Kết quả chạy Flow cytometry được biểu hiện trên hình 4.7.
45
Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh
46
Theo hình 4.7, trục tung thể hiện mức độ phức tạp của tế bào. Trục hoành là tín hiệu huỳnh quang thu được. Mầu sắc thể hiện mật độ tế bào với mầu đỏ, xanh lá cây và xanh dương lần lượt đại diện cho mật độ cao, trung bình và thấp.
Hàng trên cùng là đối chứng chỉ có tế bào CD34. Hàng thứ hai là tế bào CD34 được bổ sung kháng thể CD45 và nhuộm bởi 7AAD. Hàng thứ ba là tế bào CD34 được bổ sung đồng thời hai loại kháng thể CD34, CD45 và nhuộm bởi 7AAD.
Đối với hàng trên cùng, cột bên trái là tín hiệu huỳnh quang cho thấy tỉ lệ tế bào sống đạt mức 99,9%. Cột ở giữa là tín hiệu huỳnh quang tương ứng với CD45, do không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào nên không thu được tín hiệu. Cột bên phải là tín hiệu huỳnh quang tương ứng với CD34, do không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên CD34 trên bề mặt tế bào nên không thu được tín hiệu.
Đối với hàng thứ hai, cột bên trái vẫn cho thấy tỉ lệ tế bào sống cao ở mức 97,7%. Cột ở giữa cho thấy khi bổ sung kháng thể CD45 gắn huỳnh quang, kháng thể sẽ bắt cặp với kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào và phát sáng. Tín hiệu thu được đạt mức cao 99,7% chứng tỏ các thành phần trong thí nghiệm hoạt động tốt. Ở cột bên phải, khoảng 5% tín hiệu thu được ở bước sóng tương ứng với CD34 là tín hiệu giao thoa bởi bước sóng của CD45.
Đối với hàng thứ ba, cột bên trái và ở giữa được giải thích tương tự như hàng thứ hai. Ở cột cuối cùng, tín hiệu thu được là do sự bắt cặp của kháng thể và kháng nguyên CD34. Mức độ dương tính với CD34 56,6%. Fukuda và cộng sự đã dùng lượng tế bào CD34+ là 78% để tái lập trình [27]. Tuy nhiên lượng dương tính với CD34 trên 50% nên lượng CD34+ còn lại vẫn có thể sử dụng cho tái lập trình.