Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn
Thẩm định, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo:
- Trần Cao Sơn 2010, TCVN 9332:2012. Các thông số cần xác định:
+ Độ lặp lại, độ tái lặp, độ không đảm bảo đo ( phương pháp định lượng) + Giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng (phương pháp định tính)
Các bước thẩm định phương pháp:
B1: Đánh giá môi trường được sử dụng trong các phương pháp xét nghiệm.
Với môi trường nuôi cấy dạng đặc tiến hành đánh giá hiệu suất của môi trường theo TCVN 8128: 2015. Hiệu suất môi trường kí hiệu PR%.
23
PR% = NS/N0
PR: Hiệu suất môi trường đánh giá
NS: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường kiểm tra
N0: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường tham chiếu và phải > 100 Cách thực hiện: Lấy 1 hạt giá thể có chứa chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC®49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™ đã được hoạt hóa và bảo quản trong các ống Microbank ở -200C, tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion nuôi cấy ở 370C sau 24 giờ. Ria cấy chủng từ các ống tăng sinh trên trên các môi trường TSA tiếp tục ủ ở 370C trong 18- 24 giờ. Thực hiện các bước pha loãng, cấy lên các môi trường:
- Môi trường dùng để kiểm tổng số VSVHK 3MTM PetrifilmTM Aerobic count plate với môi trường dinh dưỡng Plate count agar (PCA) - Môi trường dùng để kiểm Coliform và E.coli 3MTM PetrifilmTM
E.coli/Coliform count plate với môi trường Plate count agar (PCA) - Môi trường Iris Salmonella agar với môi trường Tryptic Soy agar (TSA)
B2: Kiểm tra nền mẫu
- Đối với các mẫu nhiễm tự nhiên (mẫu dương tính): Kiểm tra tính ổn định của mẫu, các vi sinh vật mục tiêu có trong nền mẫu phải ổn định trong các lần kiểm tra.
- Đối với các mẫu sử dụng trong các phương pháp phân tích định tính, các nền mẫu đánh giá cần đảm bảo không nhiễm vi sinh vật mục tiêu (mẫu âm tính).
Thực hiện: Lấy riêng khoảng 1kg thịt bò, 1 kg thịt gà xay cắt nhỏ, đồng nhất riêng từng nền mẫu, mỗi nền mẫu rút ra 5 mẫu, mỗi mẫu có trong lượng 25g,
Kiểm tra tổng VSVHK theo TCVN 4884-1: 2015
Kiểm tra E.coli trong các nền mẫu theo TCVN 7924-2: 2008 Kiểm tra Salmonella trong các nền mẫu theo TCVN 4829: 2005 B3: Kiểm tra chủng chuẩn phục vụ cho việc gây nhiễm
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng gây nhiễm để đảm bảo chắc chắn các chủng chuẩn không bị biến đổi trong quá trình lưu giữ, bảo quản. Trong đề tài, sử dụng hệ thống định danh vi khuẩn Vitek 2 để test chủng (các bước chi tiết trong phương pháp định danh vi khuẩn trên hệ thống vitek 2 ở phụ lục 1).
Trước khi tiến hành gây nhiễm chủng vào mẫu, các chủng bao gồm
(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC®
49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™, Vibrio parahaemolyticus ATCC®. 17802TM, Staphylococus aureus subsp aureus ATCC®. 29213TM) được định danh lại bằng hệ thống định danh Vitek2.
Hai chủng Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™ sau khi định danh được so sánh với giấy chứng nhận sinh học từ nhà cung cấp để xem các phản ứng sinh hóa có tương đồng hay không.
Chủng gây nhiễm phải thể hiện các đặc tính nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc chuyên biệt (ví dụ: khả năng sinh hơi, lên mem trên môi trường lỏng hay khả năng sinh màu trên các môi trường chọn lọc).
B4: Xác định mật độ vi khuẩn để phục vụ cho việc gây nhiễm vào mẫu thẩm định
Sử dụng phương pháp xác định nồng độ vi sinh vật mục tiêu trong các ống pha loãng từ 100, 10-1….10-n bằng cách thăm dò từng ống trong dãy pha loãng:
Cách thức thực hiện: Lấy một khuẩn lạc của chủng E.coli, Salmonella, sau khi đã được kiểm tra đặc tính sinh hóa và đặc tính nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hòa loãng trong 9ml buffer peptone water được dịch canh khuẩn có nồng độ 100, chuyển 1ml sang ống chứa 9ml buffer peptone water được ống có nồng độ 10-1, thực hiện liên tiếp đến nồng độ 10-7, 10-8.
Xác định nồng độ vi khuẩn trong canh trùng bằng phương pháp cấy trang trên đĩa thạch theo phương pháp TCVN 4884-2:2015: Dùng Micropipep lấy 0,1ml cấy láng lên mặt thạch (có thể là môi trường dinh dưỡng TSA, hoặc một môi trường chọn lọc của vi sinh vật mục tiêu), hoặc 1ml vào đĩa thạch trong trường hợp sử dụng phương pháp đổ đĩa. Thực hiện lặp lại mỗi độ pha loãng trên 2 đĩa. Nuôi cấy trong tủ ấm ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian của phương pháp yêu cầu. Sử dụng 2 nồng độ liên tiếp để tính kết quả. Kết quả được tính theo TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).
B5 Gây nhiễm vi sinh vật vào các mẫu Bố trí thí nghiệm:
Với phương pháp định lượng:
Sử dụng vi sinh vật để gây nhiễm, hoặc các mẫu nhiễm tự nhiên, tốt nhất nằm trong khoảng phát hiện của phòng thí nghiệm trên các nền mẫu xét nghiệm
25
hàng ngày. Thực hiện gây nhiễm vào tối thiểu 10 mẫu nghiên cứu cho mỗi nền mẫu: 10 mẫu thịt gà xay và 10 mẫu thịt bò, mỗi mẫu 50g được gây nhiễm cùng một lượng vi khuẩn E.coli trong giải nồng độ từ 102 đến 104 CFU/g.
Thực hiện phân tích chỉ tiêu tổng số VSVHK theo TCVN 9977:2013 và TCVN 4884:2015 trên 10 mẫu thịt xay nhiễm tự nhiên, và 10 mẫu thịt bò gây nhiễm chủng E.coli. Đối vơi nền mẫu thịt bò, do số lượng vi sinh vật thấp nên cần phải gây nhiễm thêm một lượng vi khuẩn nhất định vào các mẫu phân tích. Sử dụng chủng E.coli để gây nhiễm vào mẫu: Mức gây nhiễm xấp sỉ 7*102CFU/g /50 g mẫu, tương đương với 2ml dịch canh khuẩn tại ống pha loãng 10-4. Thực hiện 10 lần với 10 mẫu lặp lại, liên tiếp trong 2 ngày.
Thực hiện thẩm định phương pháp định lượng E.coli theo TCVN 9975: 2013, trên nền mẫu thịt bò và thịt gà, cân 50 g/mẫu với số lần lặp trên mỗi nền mẫu (n=10). Sử dụng chủng chuẩn E,coli gây nhiễm vào 2 nền mẫu với nồng độ gây nhiễm ban đầu có giá trị 1,6* 103 CFU/g tương đương với bổ sung 0,5ml dịch canh khuẩn ở ống có nồng độ 10-3. Xét nghiệm song song 2 phương pháp TCVN 9975: 2013 và TCVN 7924-2: 2008 trong 2 ngày.
Với phương pháp định tính:
Bố trí thí nghiệm trên mỗi nền mẫu như sau (gây nhiễm 3-5 mức, với số vi khuẩn mức thấp nhất gần bằng 0, tăng dần các mức kế tiếp (Thực hiện pha loãng với hệ số pha loãng nhị phân), nồng độ vi khuẩn Salmonella enterica ở các mức như sau:
Mức 1: 1-3cfu/25g/ mẫu: lặp lại 10 lần Mức 2: 3-6cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần Mức 3: 6-10cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần Mức 4: 10-20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần Mức 5: > 20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
… đến mức n sao cho kết quả đạt được ở mức gây nhiễm nồng độ vi khuẩn thấp nhất đạt được 100% cho kết quả dương tính.
Mẫu âm tính, sử dụng 3 nền mẫu âm tính, mỗi nền mẫu lặp lại 10 lần: mẫu âm trắng, mẫu âm tính sử dụng các chủng vi sinh vật:
(Vibrio parahaemolyticus ATCC®. 17802TM, E.coli ATCC® 11303TM, Staphylococus aureus subsp aureus ATCC®. 29213TM) để gây nhiễm.
Tiến hành phân tích các mẫu đã gây nhiễm theo qui trình của 2 tiêu chuẩn.(Tiêu chuẩn mới sử dụng môi trường Iris Salmonella agar và tiêu chuẩn tham chiếu TCVN 4829:2005).
Các kết quả thu được tính các thông số: giới hạn phát hiện (LOD), độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp), độ chính xác (Ac), và hệ số tương đồng kappa (K).