3.1.1.Lập đường chuẩn
Chúng tôi tiến hành thực hiện lập đường chuẩn ở các pH của dung môi khác nhau và thu được kết quả dưới đây:
Đường chuẩn: Cephalexin
y = 0.0178x - 0.0078 R² = 0.9996
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
ĐƯỜNG CHUẨN CEPHALEXIN Ở pH=2
y = 0.0205x + 0.0046 R² = 0.9994
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 20 40 60 80 100 120
ĐƯỜNG CHUẨN CEPHALEXIN Ở pH=6
43
Hình 6: Đường chuẩn của kháng sinh CEP
3.1.2.Kiểm tra xem phương pháp có mắc sai số hệ thống hay không Dựa theo đường chuẩn trên ta có phương trình hồi quy đầy đủ của kháng sinh phân tích ở các điều kiện ph khác nhau có dạng y =a + bx đƣợc thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 5. Phương trình hồi quy đầy đủ của kháng sinh Cephalexin Kháng sinh Phương trình
Cephalexin y = 0,0206x + 0,0043
Tuy nhiên, phương pháp tiến hành để xây dựng đường chuẩn của các kháng sinh có thể mắc sai số hệ thống, do đó để kiểm tra xem phương pháp có mắc sai số hệ thống hay không ta cần tiến hành kiểm tra các giá trị a của phương trình hồi quy và và giá trị 0 với độ tin cậy thống kê là P = 0,95.
Các phương trình trên đều có dạng y =a +bx. Nếu xem a ~ 0 thì phương trình được viết thành dạng y = b’x. Thay các giá trị yi và xi vào phương trình y = b’x ta s tính đƣợc các giá trị bi’ và tính b’ là trung bình cộng các giá trị bithu đƣợc.
y = 0.0201x + 0.0005 R² = 0.9999
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
ĐƯỜNG CHUẨN CEPHALEXIN Ở pH=9
44
Sau đó đánh giá sự sai khác giữa giá trị a và giá trị ) theo chuẩn F ( tính theo chỉ số của 2 phương sai của 2 phương trình sao cho F >1) và so sánh giá trị này với F(P,f1,f2) với P=0,95 và f1 = n-3 =3, f2 =n-2 =4. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 6. Các thông số liên quan đến phương trình hồi quy Chất phân
tích Phương trình hồi quy Phương sai Ftính Fbảng
CEP y' = 0,0810x Sy’ =0,0016
1,05 6,59 y= 0,0206x + 0,0043 Sy=0,0286
Từ kết quả tính toán nhận thấy các giá trị Ftính<Fbảng , nhƣ vậy sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 là không có ý nghĩa, hay có thể coi a =0.Nhƣ vậy phương pháp trắc quang không mắc sai số hệ thống. Vì vậy với mục tiêu nghiên cứu là các mẫu dƣợc phẩm nên chúng tôi tiến hành chọn các điều kiện phân tích này.
3.1.3.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩn (LOQ)
a) Giới hạn phát hiện (LOD): giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng)
Giới hạn phát hiện là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân tích. Để xác định LOD của các β-lactam chúng tôi tiến hành xác định LOD dựa vào đường chuẩn
Theo (*) giới hạn phát hiện đƣợc tính theo công thức sau:
LOD = 3×Sy/b
Trong đó: Sy : là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn b : là hệ số góc của phương trình hồi quy
45
b)Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) : đƣợc định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất mà phép phân tích vẫn định lƣợng đƣợc chính xác với độ tin cậy 95%. Theo lý thuyết thống kê thì giới hạn định lƣợng là nồng độ chất phân tích có tín hiệu phân tích gấp 10 lần tín hiệu nhiễu của đường nền.
LOQ = 10×Sy/b
Bảng 7.Giới hạn phát hiện của phương pháp Chất
phân tích
Phương trình y = a + bx
Hệ số góc (b)
Độ lệch chuẩn (Sy)
LOD (mg/l)
LOQ (mg/l) CEP y= 0,0206x + 0,0043 0,0206 0,0286 4,16 13,89
Với kết quả trình bày ở trên, chúng tôi lấy giới hạn định lƣợng của các β – lactam là 13,89 mg/l.
3.1.4.Độ chính xác của phép đo
Để đánh giá sai số của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành chọn ba mẫu tương ứng với khu vực: điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính đã đƣợc chọn ở trên. Các mẫu đƣợc chọn có nồng độ lần lƣợt là 30mg/l; 50mg/l và 80 mg/l. Tiến hành đo các mẫu trên với điều kiện tương tự như các điều kiện khi khảo sát khoảng tuyến tính. Mỗi mẫu tiến hành đo 5 lần. Sai số đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó: Ai là độ hấp thụ quang tính từ đường chuẩn At là độ hấp thụ quang đo đƣợc trên thực tế Kết quả phân tích đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 8. Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (Cephalexin)
STT 1 2 3 4 5 TB
30mg/l
At 0.629 0.625 0.627 0.629 0.628 0.628 Ai 0.624 0.624 0.624 0.624 0.624 0.624 X% 0.795 0.160 0.478 0.795 0.637 0.573
46 50mg/l
At 0.835 0.837 0.834 0.836 0.837 0.836 Ai 0.832 0.832 0.832 0.832 0.832 0.832 X% 0.359 0.597 0.240 0.478 0.597 0.454
80mg/l
At 1.650 1.648 1.651 1.649 1.650 1.650 Ai 1.646 1.646 1.646 1.646 1.646 1.646 X% 0.242 0.121 0.303 0.182 0.242 0.218 Nhận xét: Từ kết quả tính toán ở trên, chúng tôi nhận thấy vùng nồng độ lớn cho sai số nhỏ, vùng nồng độ nhỏ cho sai số lớn nhƣng đều nằm trong giới hạn cho phép ( < 10 %).
3.1.5.Độ lặp lại của phép đo
Một phương pháp phân tích tốt ngoài việc có sai số nhỏ còn yêu cầu có độ lặp lại cao. Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại ở 3 nồng độ 30, 50, 80 mg/l đối với Cephalexin. Dựa vào kết quả thực nghiệm của phần trước, tiến hành tính độ lặp lại dựa trên việc xác định độ lệch chuẩn và hệ số biến động theo công thức sau:
Độ lệch chuẩn:
Hệ số biến động:
Trong đó:
Ai là độ hấp thụ quang của mẫu phân tích đo ở lần thứ i Atb là độ hấp thụ quang của n lần đo (n = 5)
S là độ lệch chuẩn của phép đo V là hệ số biến động của phép đo
Các kết quả tính toán đƣợc biểu diễn ở bảng sau:
47
Bảng 9. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích Nồng độ
CEP Độ lệch chuẩn
(S)
Giá trị T (ATB)
Hệ số biến động(V%)
30 mg/l 0,0017 0,6238 0,28
50 mg/l 0,0025 1,0008 0,25
80 mg/l 0,0026 1,6458 0,12
Nhận xét : Qua bảng 9 đánh giá độ lặp lại của phép đo chúng tôi nhận thấy độ lệch chuẩn và hệ số biến động của chất phân tích tương đối nhỏ, mặc dù với nồng độ 30 mg/l thì hệ số biến động lớn hơn so với nồng độ 50mg/l và 80mg/l song các giá trị này vẫn nằm trong giới hạn. Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt.