Tách chiết ADN tổng số từ mô

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân đƣợc lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô được cân với lượng tương đương 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

 Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 àl buffer ATL và 20 àl proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô đƣợc thủy phân hoàn toàn.

 Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thờm 200 àl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thờm 200 àl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tõm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

 Bổ sung lờn cột 500 àl buffer AW1. Đúng nắp, ly tõm ở 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

29

 Bổ sung lờn cột 500 àl buffer AW2. Đúng nắp, ly tõm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bước này thêm 1 phút nếu chưa hết dịch trên cột.

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

Thờm 200 àl buffer AE hoặc nước sạch. Đặt ở nhiệt độ phũng trong 1 phỳt và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bước trên 2 lần.

 Làm khô dịch thu đƣợc bằng máy Speed vac trong 2h.

 Hũa tan ADN trong 50àl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.

 Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.

2.2.2. Khuếch đại đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013 bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).

Các cặp mồi được chúng tôi thiết kế bằng chương trình Primer premier 5.

Trình tự các cặp mồi đƣợc trình bày ở bảng 6.

Bảng 6. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi Trình tự mồi Kích thước sản

phẩm (bp)

10398

f 5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’

246

r 5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’

3243

f 5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’

218

r 5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

30

PCR đươ ̣c thực hiê ̣n với các thành phần của phản ứng như trong bảng 7.

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l

Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng

Master Mix 2x 6,25 1X

Primer F 10àM 0,25 0,2 M

Primer R 10àM 0,25 0,2 M

ADN khuôn 2

Nước 3,75

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 nhƣ sau:

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 3243 nhƣ sau:

31 2.2.3. Phân tích RFLP

Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.

+ Vớ i đoa ̣n gen 10398 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme này có vị trí nhận biết trên ADN nhƣ sau:

5’…C/TNAG…3’

3’…GANT/C…5’

Phân tích vi ̣ trí nhâ ̣n biết các enzyme giới ha ̣n trên đoa ̣n gen 246 bp và nhâ ̣n thấy trong trường hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở một vị trí và tạo thành các đoa ̣n oligonucleotide có kích thước 50 bp và 196 bp.

Trong trường hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở 2 vị trí và kết quả cắt enzyme thu được các đoạn oligonucleotide có kích thước 38 bp, 50 bp và

158 bp.

+ Vớ i đoa ̣n gen 3243 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzym e cắt FastDigest® HaeIII nhận biết vi ̣ trí cắt trên ADN ta ̣i trình tƣ̣:

5’…GG/CC…3’

3’…CC/GG…5’

Đoa ̣n gen 3243 đươ ̣c nhân lên có kích thước 218 bp. Trong trường hợp không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoa ̣n gen này ta ̣i hai vi ̣ trí , dẫn tới sản phẩm thu đươ ̣c là các đoa ̣n có kích thước 22 bp, 27 bp và 169 bp.

Trong trường hợp có đột biến 3243G thì vi ̣ trí này sẽ trở thành vi ̣ trí cắt của HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiê ̣n các đoa ̣n có kích thước 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.

32

Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất . Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI đươ ̣c mô tả trong bảng 8.

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Thành phần Thể tích

10X FastDigestđ buffer 2àl Sản phẩm PCR (~0.2 àg) 10àl

FastDigestđ enzyme 1àl

Nước Bổ sung đến đủ 30 àl

Thành phần phản ứng s au khi đươ ̣c trô ̣n đều thì tiến hành ủ ở 37 0C theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp đƣợc trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút trong bể ổn nhiệt ở 370C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn Điện di là kỹ thuật đƣợc dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt như protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hướng tới cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào

33

kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.

2.2.4.1. Điện di gel agarose

Điện di gel agarose đƣợc thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel đƣợc trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6]

Nồng độ gel (%w/v) Dãy kích thước tách hiệu quả (kb)

0,5 2–25

0,7 0,8–10

1,2 0,4–5

1,5 0,2–3

2,0 0,1–2

2,5 0,05–1,5

Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di đƣợc thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (UV).

Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR

 Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)

 Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).

34

 Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lƣợc để tạo giếng.

 Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20–30 phút).

 Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.

 Bản gel sau điện di được nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia tử ngoại (UV).

2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide được tổng hợp ngay trước khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis–

acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lưới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tương tự, tùy hàm lượng của bis–acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thước và điện tích của ADN.

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6]

Nồng độ gel (%w/v) Giới hạn phân tách với ADN (bp)

5 80500

8 60400

12 50300

15 40200

20 5100

35

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để đi ện di kiểm tra sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm

Thành phần Thể tích

Monoacrylamide 30% 1,33 ml

TBE 1X 3,67 ml

APS 10% 37,5 l

TEMED 3 l

Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di đƣợc nhuộm bạc theo phương pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bước sau:

 Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.

 Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.

 Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO3; 0,056% formaldehyde) trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.

 Rửa nước khoảng 30 giây–1 phút.

 Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 àg/l natri thiosulfate Na2S2O3) trong 3–5 phỳt.

 Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.

 Bảo quản gel bằng nước cất.

 Quan sát kết quả dưới ánh sáng trắng.