Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G

Sử dụng kỹ thuật RFLP, chúng tôi đã xác định đƣợc đột biến A10398G ở một số cặp mẫu. Để khẳng định kết quả, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau tinh sạch đƣợc lấy ra kiểm tra sự hiện diện của băng ADN. Theo tính toán, lƣợng ADN tinh sạch thu đƣợc nằm trong khoảng 200-400 Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp.

Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen G ở vị trí 10398.

Giếng 7: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen A ở vị trí 10398.

Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt bằng DdeI từ mẫu mang alen G ở vị trí 10398.

Giếng 6: sản phẩm sau cắt bằng DdeI từ mẫu mang alen A ở vị trí 10398.

43

ng/àl. Lƣợng ADN này đủ sạch và cú đủ lƣợng để đem giải trỡnh tự. Sử dụng phần mềm Sequence Scanner để ph ân tích kết quả giải trình tự và sử du ̣ng chương trình BLAST để so sánh trình t ự thu đươ ̣c v ới trình tự ADN chuẩn của ty thể đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI (NC_012920), chúng tôi đã xác định đƣợc đi ểm đột biến trên hệ gen ty thể.

Với đoạn gen 10398, chúng tôi đã gửi đi giải trình tự 4 mẫu (gồm hai mẫu không đột biến và hai mẫu đột biến) (xem phụ lục 2). Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến đƣợc biểu diễn trên hình 12.

Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G

So sánh trình tự thu được với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trên hình 13.

44

Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể

Từ kết quả ở hình 13 cho thấy alen A xuất hiện ở vị trí 10398 tại mẫu không mang đột biến (alen A đƣợc bôi xanh). Điều này cho thấy không có đột biến xuất hiện. Kết quả này hoàn toàn phù hơ ̣p với kết quả phân tích RFLP.

Kết qủa giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G đƣợc biểu diễn ở hình 14.

Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G

45

So sánh trình tự thu được với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trên hình 15.

Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể

Kết quả từ hình 15 cho thấy alen G xuất hiện ở vị trí 10398 tại mẫu mang đột biến (alen G đƣợc bôi xanh). Điều này cho thấy có xuất hiện đột biến A→G. Kết quả này hoàn toàn phù hơ ̣p với kết quả phân tích RFLP. Nhƣ vậy bằng kỹ thuật giải trình tự, chúng tôi đã xác định đƣợc điểm đột biến trên hệ gen ty thể tại vị trí 10398.

Kết quả giải trì nh tƣ̣ còn cho thấy có 2 dạng biến thể khác là T 10370C và

C10400T. Dựa vào các dữ liệu đã đƣợc công bố trên Mitomap (ngân hàng dữ liệu genome ty thể) thấy rằng hai dạng biến thể này không liên quan tới đột biến gây bệnh, mà chỉ là đa hình trong các nhóm đơn bội. Đa hình C10400T thuộc siêu nhóm đơn bội M [62], còn biến thể T10370C thuộc dạng biến thể thường, không gây bệnh [50].

46

3.2.4. Phân tích mối liên quan giƣ̃a đa hình A 10398G với các đă ̣c điểm bê ̣nh học lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đ ại trực tràng

Kết quả phân tích PCR–RFLP của 122 mẫu ADN tổng số của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng (trong đó có 61 mẫu ADN tổng số của mô u và 61 mẫu ADN tổng số của mô lân câ ̣n u ) đã cho thấy có xuất hiện đột biến ADN ty thể ở vị trí 10398. Tiến hành phân tích mối liên quan giữa đột biến điểm A10398G của ADN ty thể của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng vớ i các đă ̣c điểm lâm sàng khác, chúng tôi thu đƣợc kết quả trong bảng 12.

Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Đặc điểm Số lƣợng

Phân bố A10398G

A G

Giới tính

Nam 30 50,0

(15)

50,0 (15)

Nữ 31 41,9

(13)

58,1 (18)

Tuổi

≥ 50 46 47,8

(22)

52,2 (24)

< 50 15 40

(6)

60 (9)

Vị trí ung thƣ

Đại tràng 30 56,7

(17)

43,3 (13)

Trực tràng 29 37,9

(11)

62,1 (18) Giữa đại và

trực tràng 2 0

(0)

100 (2)

Hạch 0 3 66,7 33,3

47

(2) (1)

13 15 60

(9)

40 (6)

>3 27 37

(10)

63 (17)

Kích thước u

<5cm 28 35,7

(10)

64,3 (18)

 5cm 22 59

(13)

41 (9)

Phân loại TNM

Giai đoạn I T1-2N0M0

16 37,5

(6)

62,5 (10) Giai đoạn II

T3-4N0M0

20 60

(12)

40 (8) Giai đoạn III

N1-2M0 T bất kỳ

21 42,9

(9)

57,1 (12) Giai đoạn IV

M1 T, N bất kỳ

3 0

(0)

100 (3)

Mức độ biệt hóa

Cao 5 60

(3)

40 (2)

Vừa 20 52,4

(11)

47,6 (9)

Kém 2 0

(0)

100 (2)

48

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí mô

Nhằm đánh giá mối liên hệ giữa đa hình A10398G của ADN ty thể với vị trí của mô đại trực tràng, chúng tôi đã khảo sát sự phân bố đa hình A10398G của ADN ty thể theo mẫu mô u và mẫu mô lân cận u. Kết quả trình bày ở hình 16.

Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô

Kết quả từ hình 16 cho thấy tần xuất alen A và G giữa mô u và mô lân cận u không có sự khác biệt, trong đó tần suất xuất hiện của alen A là 46% (28/61), alen G là 54% (33/61). Tần suất này phù hợp với nghiên cứu của Juo và cs (2010) trên đối tượng là người Trung Quốc mắc các bệnh thuộc hội chứng chuyển hóa với các biểu hiện như đường máu cao, rối loạn lipid, tăng huyết áp và béo phì, với tần suất của alen G là 57,1% trên các mẫu bệnh, và 52,7% trên các mẫu đối chứng [34].

Tần suất alen ở vị trí 10398 mang tính đa hình cao, khác nhau giữa các nhóm tộc người phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau, cụ thể là tần suất alen G ở nhóm người Mỹ gốc Phi là 87% [18], Bắc Ấn Độ là 57,3% [26], người Mỹ gốc Âu là 32,1% [12]. Nhƣ vậy tần suất alen đƣợc xác định trong nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là người châu Á.

49

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo giới tính

Ung thƣ đại trực tràng đƣợc coi là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến nhất ở nam giới bởi một trong những nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng là thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên. Điều này có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng. Để tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình A10398G với giới tính của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, chúng tôi đã tiến hành phân tích thống kê và kết quả đƣợc đƣa ra ở hình 17.

Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính

Kết quả từ hình 17 cho thấy tần suất xuất hiện của alen A ở nam giới là 50%, ở nữ là 41,9%. Tần suất xuất hiện của alen G ở nữ giới lại cao hơn ở nam giới (58,1% và 50%). Bằng phép kiểm định χ2 chúng tôi nhận thấy sự khác biệt về tần suất alen giữa hai giới không mang ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α= 0,05 (χ2 = 0,399 < χ21(0,05) = 3,84).

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo tuổi

Ung thư đại trực tràng thường tâ ̣p trung ở đô ̣ tuổi trung niên. Do đó chúng tôi đã tiến hành phân tích mối liên quan giƣ̃a đa hình A 10398G vớ i đô ̣ tuổi của các bê ̣nh nhân ung thu đại trực tràng. Kết quả phân tích đươ ̣c trình bày trong hình 18.

50

Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi

Số liệu từ hình 18 cho thấy các bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng phần lớn là hơn 50 tuổi (46/61 bệnh nhân). Tần suất xuất hiện alen G cao hơn alen A ở cả hai nhóm tuổi (nhóm <50 tuổi 10398 G chiếm 60%, nhóm >50 tuổi là 52,2%). Tuy vậy sự khác biệt về tần suất alen giữa hai nhóm không có ý nghĩa thống kê (χ2 = 0,278 < χ21(0,05) = 3,84, p>0,05).

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí khối u

Ung thƣ có thể diễn ra ở đại tràng, trực tràng hay đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng (ung thƣ đại trực tràng). Kết quả khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí khối u đƣợc biểu diễn ở hình 19.

51

Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u.

Số liệu từ hình 19 cho thấy vị trí khối u tập trung chủ yếu ở trực tràng và đại tràng, một phần nhỏ ở vùng giữa đại và trực tràng (2/61 bệnh nhân). Alen G xuất hiện với tần suất cao nhất ở ung thƣ ở vùng giữa đại và trực tràng (100%), tiếp đó là

ung thƣ trực tràng (62,1%), cuối cùng là ung thƣ đại tràng (43,33%). Alen A không xuất hiện ở vùng giữa đại và trực tràng. Có sự khác nhau giữa tần suất các alen với vị trí khối u, tuy vậy sự khác nhau này không mang ý nghĩa thống kê (χ2 = 3,838 <

χ22(0,05) = 5,991, p>0,05).

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo kích thước u

Kích thước khối u được biết đến như là một trong những yếu tố giúp tiên lƣợng bệnh ung thƣ đại trực tràng, đặc biệt có ý nghĩa chẩn đoán trong ung thƣ đại tràng. Nó có liên quan đến quá trình tiến triển và khả năng sống sót trong ung thƣ đại tràng [39]. Do đó chúng tôi đã tiến hành phân tích mối liên quan giƣ̃a đa hình A10398G vớ i kích thư ớc khối u. Kết quả phân tích thống kê đươ ̣c trình bày trong hình 20.

52

Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u

Kết quả từ hình 20 cho thấy tần suất xuất hiện alen A trong nhóm có kích thước u ≥ 5cm là 59%, alen G là 41%. Trong nhóm có kích thước u < 5cm tần suất của alen G lại gần gấp đôi alen A (64,3% và 35,7%). Sự khác biệt giữa phân bố đa hình với kích thước u không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,71 < χ21(0,05) = 3,84, p>0,05.

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo số hạch lympho

Số lƣợng hạch lympho là một trong những yếu tố quan trọng giúp phân loại giai đoạn bệnh và có ý nghĩa trong việc tiên lƣợng khả năng sống sót của bệnh nhân. Do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát đa hình A10398G theo số hạch lympho để tìm hiểu mối liên quan giữa chúng. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn trong hình 21.

53

Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch.

Kết quả từ hình 21 cho thấy số hạch tăng lên thì tần suất xuất hiện alen G cũng tăng lên và đạt nhiều nhất ở nhóm có số hạch >3 (63%). Tần số alen A lớn nhất ở nhóm không xuất hiện hạch (66,67%). Như vậy người mang alen G có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng với mức độ nguy hiểm cao hơn người mang alen A. Sự khác biệt giữa tần suất alen và số hạch không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,559 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05.

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo giai đoạn phát triển khối u

Trong nghiên cứu này các giai đoạn phát triển khối u đƣợc phân loại theo hệ thống TNM, với 4 giai đoạn. Việc phân loại giai đoạn phát triển của bệnh có ý nghĩa rất lớn trong việc tiên lƣợng bệnh và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát, tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển khối u. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn ở hình 22.

54

Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM

Số liệu ở hình 22 cho thấy tần suất alen A cao nhất ở giai đoạn II, đạt tới 60%. Ở giai đoạn IV không có bệnh nhân nào mang alen A. Giai đoạn I là giai đoạn bệnh còn ở mức nhẹ, ung thƣ đã bắt đầu lây lan, nhƣng vẫn còn trong lớp lót bên trong đại trực tràng, chƣa lan đến các cơ quan khác. Ở giai đoạn I này alen G có tần suất đạt 62,5%. Tiếp đó tần suất alen G có sự giảm ở giai đoạn II (40%) và tăng trở lại ở giai đoạn III (57,14%). Alen G có tần suất xuất hiện lớn nhất ở giai đoạn IV (100%). Đây là giai đoạn nặng nhất của bệnh với sự di căn của khối u tới các cơ quan xa (phổi, gan) thông qua hệ bạch huyết. Khả năng sống sót của bệnh nhân sau 5 năm ở giai đoạn này chỉ đạt từ 0-7%. Điều này lại một lần nữa khẳng định cho giả thuyết alen G làm tăng nguy cơ đối với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Sự khác biệt giữa phân bố đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển ung thƣ TNM không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 4,675 < χ23(0,05) = 7,814, p>0,05.

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo mức độ biệt hóa

Mức độ biệt hóa là một khái niệm dùng để chỉ mức độ giống các tế bào bình thường cùng một loại mô của các tế bào u. Mức độ ác tính của ung thư có liên quan trực tiếp đến nguồn gốc của tế bào biệt hóa. Thông thường, những khối u có tính biệt hóa cao, tế bào ung thư thường phát triển chậm, mức độ ác tính thấp, di căn

55

chậm. Mặt khác những khối u có tính biệt hóa thấp thì độ ác tính lại cao, di căn nhanh. Kết quả của việc khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể theo mức độ biệt hóa đƣợc biểu diễn trong hình 23.

Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa

Kết quả từ hình 23 cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự giảm của mức độ biệt hóa, đồng nghĩa với việc tăng dần của độ ác tính và tốc độ di căn của khối u.

Đối với alen A thì ngƣợc lại, đạt cao nhất ở mức đô độ biệt hóa cao (60%), thấp nhất ở mức biệt hóa kém (0%). Kết quả này cũng phù hợp với giả thuyết alen G làm tăng mức độ nguy hiểm với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Sự khác biệt giữa tần suất alen và mức độ biệt hóa không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,366 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05.

Nhƣ vậy qua việc khảo sát sự phân bố đa hình A10398G theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng, chúng ta thấy đƣợc một số đặc điểm sau:

- Tần suất xuất hiện của alen A ở mô u và mô lân cận u là 46%, của alen G là 54%.

Không có sự khác biệt về tần suất alen giữa mô u và mô lân cận u. Sự phân bố đa hình này phù hợp với các nghiên cứu về đa hình A10398G trên đối tượng người châu Á (khu vực miền Bắc Ấn Độ: 57,3%, Trung Quốc 57,1%).

56

- Alen A và G phân bố trên cả nam và nữ. Tần suất alen G ở nam là 50%, ở nữ là 58,1%. Ở nhóm có độ tuổi ≥ 50, tần suất alen G là 52,2%, ở nhóm <50 tuổi, tần suất alen G là 60%. Alen G xuất hiện nhiều ở ung thƣ trực tràng và ung thƣ giữa đại và trực tràng. Với nhóm có khối u kích thước nhỏ hơn 5cm, alen G chiếm 64,3%.

- Khảo sát mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm nhƣ số hạch lympho, giai đoạn phát triển khối u, mức độ biệt hóa cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự tăng của số hạch, sự tăng của giai đoạn phát triển bệnh và sự giảm của mức độ biệt hóa. Điều này cho thấy alen G có mối liên quan với nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng.

Mối liên quan giữa đa hình A10398G với sự phát triển của khối u đã thu đƣợc nhiều mối quan tâm của các nhà nghiên cứu trong những năm gần đây. Canter và cs (2005) lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình A10398G với bệnh ung thư vú trên những người phụ nữ Mỹ gốc Phi, trong đó alen A là yếu tố gây nguy cơ mắc bệnh, có khả năng tham gia vào quá trình tạo gốc tự do. Tuy vậy, các tác giả không tìm thấy mối liên hệ nào ở người Mỹ da trắng. Các tác giả cho rằng sự tương tác giữa các yếu tố gen và môi trường có thể gây ra sự khác nhau giữa các tộc người [18]. Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối tượng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trò của đa hình 10398A đối với sự phát triển của ung thƣ vú [55]. Các tác giả đã giải thích sự khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện trong các khu vực địa lý khác nhau. Trong một số nghiên cứu khác, alen G lại có liên quan với sự phát triển khối u. Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 người phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú và 260 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thƣ vú [12].

Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển ung thư vú trên đối tượng là người Ba Lan [25]. Khi nghiên cứu trên đối tượng là người Mỹ gốc Phi mắc ung thư tiền liệt tuyến, người ta thấy rằng 10398G làm tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh.

Như vậy vẫn tồn tại những kết quả dường như trái ngược về việc xác định alen nào nào thƣc sự có vai trò với sự phát triển của khối u. Chúng ta biết rằng các

57

đột biến soma có thể bị gây ra bởi tác động của yếu tố ngoại cảnh, nhƣ tia cực tím, hay một số thói quen nhƣ hút thuốc, sử dụng bia rƣợu. Các yếu tố này đều góp phần làm tăng lƣợng gốc tự do trong cơ thể. Theo một số nghiên cứu, cùng với sự tăng của các gốc tự do, mtSNP sẽ có vai trò trong việc phát triển ung thƣ, có thể hoạt hóa con đường gây ung thư, hoặc có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis, vốn đóng vai trò là yếu tố bảo vệ trong giai đoạn cuối của ung thƣ. Nhƣ vậy phải chăng các alen A hoặc G trong đa hình A10398G có thể cần kết hợp với một vài yếu tố nào đó để từ đó hình thành nên mối liên hệ với sự hình thành khối u. Chúng ta có thể thấy rõ hơn khả năng này nhờ nghiên cứu của Pezzotti và cs (2009). Khi phân tích mối liên quan giữa việc sử dụng chất có cồn với đa hình A10398G ở bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú, Pezzotti và cs (2009) đã phát hiện ra rằng ở những người phụ nữ không sử dụng rƣợu và mang alen G, nguy cơ mắc ung thƣ vú thấp hơn 21% so với những người không uống rượu và không mang alen này [52]. Như vậy việc sử dụng cồn là một yếu tố kết hợp với alen G trong đa hình A10398G để hình thành mối liên hệ giữa đa hình với bệnh ung thƣ vú.

Tóm lại, trong nghiên cƣ́ u này, chúng tôi đã tiến hành phân tích đ ột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RFLP 61 cặp mẫu mô u và mẫu mô lân cận u c ủa 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng cho thấy không xuất hiện đột biến A3243G mã hóa cho gen tARNLeu. Khi tiến hành phân tích đa hình A10398G của gen ND3 của ADN ty thể, chúng tôi đã xác định đƣợc tần xuất của alen A và G trên 61 cặp mẫu mô u và mẫu mô lân câ ̣n u của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả phân tích cho thấy tỷ

lê ̣ alen G trong nh óm bệnh nhân được nghiên cứu tương ứng với tỷ lệ alen G đã đươ ̣c công bố bởi các tác giả khác khi nghiên cứu trên các nhóm người ở các nước Châu Á. Ngoài ra, sự khác biệt giữa phân bố đa hình A10398G theo các đă ̣c điểm bê ̣nh ho ̣c l âm sàng của bê ̣nh ung thƣ đ ại trực tràng nhƣ vi ̣ trí mô , tuổi, giới tính, kích thước u, số hạch lympho, giai đoạn tiến triển bệnh, mức độ biệt hóa không mang ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, do số lươ ̣ng bê ̣nh nhân đươ ̣c nghiên