3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng
Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức), chúng tôi đã tách chiết đƣợc ADN từ 61 cặp mẫu mô (mẫu u và mẫu lân cận u) của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả tách chiết ADN tổ ng số tƣ̀ các mẫu mô đƣợc minh họa trong hình 7.
Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô (điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide).
Giếng 1, 3, 5: ADN tổng số mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: ADN tổng số mẫu mô u
Qua hình ảnh điện di trên ta thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lƣợng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
38
3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 3243 với khuôn là ADN tổng số từ mô, đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể đã đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan sát dưới tia cực tím. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 8.
Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 (điê ̣n di trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide).
Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp Giếng (-): Đối chứng âm Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân
cận u
Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u
Kết quả điện di cho thấy đã thu được sản phẩm PCR có kích thước 218bp, các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng tỏ không có hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu. Sản phẩm PCR này đƣợc tiếp tục phân tích bằng kỹ thuật RFLP để xác định đột biến.
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể
Để xác định đột biến điểm A3243G, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP.
Chúng tôi đã tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 3243 với enzyme giới hạn HaeIII. HaeIII là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại trình tự:
39
Trong trường hợp không có đô ̣t biến thì đoa ̣n gen 218 bp có chứa hai vị trí nhận biết của enzyme, và sẽ bi ̣ cắt thành ba đoa ̣n nhỏ hơn có kích thước 22 bp, 27 bp và 169 bp. Trong trường hợp đô ̣t biến A G xảy ra thì đoa ̣n gen 218 bp sẽ có thêm một vị trí nhận biết nữa của enzyme giới hạn, kết quả là đoạn gen sẽ bị cắt thành các đoạn nhỏ có kích thước là 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp. Sản phẩm của quá trình xử lý với enzyme cắt đƣợc điện di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV bước sóng 245 nm (hình 9).
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 vớ i enzyme HaeIII.
(điện di trên gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide).
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mô u Giếng 7: sản phẩm PCR từ mô lân cận u
Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt bằng HaeIII từ mẫu mô u
Giếng 6: sản phẩm sau cắt bằng HaeIII từ mẫu mô lân cận u
Từ kết quả thu đƣợc trong hình chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR sau khi cắt bằng HaeIII trên bản điện di xuất hiện băng kích thước 169 bp. Hai băng kích
40
thước 22 bp, 27 bp không quan sát được do gel không phân tách được. Như vậy ở các giếng này không xuất hiện đột biến. Chúng tôi đã tiến hành cắt enzym với 61 cặp mẫu, kết quả thu đƣợc không có đột biến.
Đột biến A3243G trên gen MT -TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR) đã đươ ̣c phát hiện ra đầu tiên nhƣ là mô ̣t nguyên nhân di truyề n của bệnh MELAS [31]. Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh cơ thần kinh, tiểu đường. Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G trên bệnh nhân ung thƣ trực tràng. Lorenc và cs (năm 2003) khi nghiên cứu các đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung thƣ, đã phát hiện một mẫu ung thƣ trực tràng có đột biến A3243G dạng đồng nhất (homoplasmic) [46]. Nhƣ vậy có thể thấy rằng đột biến A3243G là khá hiếm gặp ở bệnh ung thƣ.