CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật
Chủng giống vi khuẩn S. marcescens DT3 từ tủ lạnh -84oC được hoạt hóa lại trên môi trường LB agar ở 28oC từ 3-5 ngày. Sau đó lấy một khuẩn lạc riêng rẽ nuôi vào bình 50 ml chứa 10 ml môi trường LB trong 12 giờ. Chủng giống được nuôi chuyển vào bình lên men lớn các bình 1000 ml chứa 250 ml môi trường lên NA với tỉ lệ 3-5% (v/v), chủng giống được nuôi ở 28oC, 200 rpm trong 2 ngày. Như vậy, chủng S. marcescens DT3 được nuôi trong môi trường NA có thành phần như sau 0,5% pepton, 0,5% Nacl, 0,3% cao nấm men [24,38].
2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm Thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng
Khả năng ức chế sinh trưởng nấm của dịch lọc tế bào được xác định theo phương pháp của Huber và cộng sự (1987) [22]. Dịch nuôi cấy chủng S. marcescens DT3 được ly tâm loại bỏ tế bào ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, tiếp đó loại tế bào còn sót được loại sạch bằng cách lọc qua màng lọc vi khuẩn Satorrius với kích thước lỗ 0,2 μm. Dịch lọc tế
Trần Thị Thùy Linh 20 K22
bào được bổ sung vào 20 ml môi trường PDA ở 55oC, trộn đều và đổ vào mỗi đĩa Petri.
Cuối cùng một khoanh nấm bệnh cây 4 ngày tuổi được đặt ngay chính giữa mặt đĩa môi trường và ủ ở 30oC. Sau 3-5 ngày kiểm tra sự sinh trưởng bằng cách đo đường kính tản nấm với thước kẻ có phân độ mm. Thí nghiệm đối chứng được tiến hành song song. Hoạt tính ức chế tương đối sinh trưởng nấm của dịch lọc tế bào được tính theo công thức sau đây:
I là phần trăm ức chế sinh trưởng nấm;
SĐC là diện tích tản nấm trên môi trường PDA không chứa dịch lọc tế bào;
SST là diện tích tản nấm trên môi trường PDA chứa dịch lọc tế bào.
Thử nghiệm khoanh giấy lọc
Lấy10 ml môi trường PDA ở 50oC có bổ sung 0,1% ampicillin đổ vào đĩa petri để ráo mặt thạch, đặt nấm thử nghiệm vào giữa đĩa. Sau đó đặt các khoanh giấy lọc có đường kớnh 0,5 cm vào đĩa thạch. Tiếp theo hỳt 20 àl protein tinh sạch nhỏ vào cỏc khoanh giấy lọc, đặt đĩa vào tủ nuôi 30oC ủ trong 3 ngày đến 5 ngày kiểm tra, mẫu đối chứng âm là đệm potasium photphate 20 mM, pH 6,8.
2.2.3 Phương pháp kết tủa phân đoạn
Cơ sở của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch protein thô ban đầu. Các loại muối có thể được dùng là muối (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… nhưng muối tốt nhất là muối (NH4)2SO4 protein. Hơn nữa chi phí cho loại muối này thấp và phổ biến. Độ hòa tan của nó rất lớn (bão hòa 767 g/l ở 25oC). Hàm lượng muối amonium sulfate ở các nồng độ bão hòa lần lượt là 30% và 70%
được lấy theo nghiên cứu của Green và Hughes [20]. Các bước tủa và ly tâm được thực hiện ở 4oC.
Trần Thị Thùy Linh 21 K22
Theo một số nghiên cứu trong nước và quốc tế cho thấy tủa protein bằng muối amonium sulfate thường được tủa ở những nồng độ như 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%
độ bão hòa [41,42,45]. Một số protein kháng nấm đã được tủa ở nồng độ 30% và 70%
bão hòa nên chúng tôi đã chọn tủa protein kháng nấm từ chủng S. marcescen DT3 ở các nồng độ muối là 30% và 70% [3,27].
Tiến hành tủa 30%: Lấy 100 ml dịch chiết ngoại bào chủng S. marcescens DT3 và 17,6 g muối amonium sulfate. Cho muối amonium sulfate từ từ vào dịch chiết ngoại bào.
Dịch sau đó được li tâm 12000 vòng trong 10 phút, giữ lại dịch loại bỏ tủa. Thu được 105 ml dịch sau khi tủa 30%, dịch này được tiếp tục tủa với muối amonium sulfate ở nồng độ 70%. Cho từ từ 49,56 g muối amonium sulfate vào 105 ml dịch trong vòng một giờ thu được 130 ml dịch. Dịch này để qua đêm sau đó li tâm thu tủa, tủa được hòa tan vào đệm potassium phosphate 20 mM, pH 6,8 và được thẩm tích để loại muối. Sau khi đã thẩm tích loại muối thì tiếp tục đưa lên cột DEAE – cellulose để tinh sạch.
2.2.4 Sắc kí trao đổi ion
Sắc kí trao đổi ion DEAE – cellulose: dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi anion giữa protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điện dương) của chất giá, khi hỗn hợp protein qua cột, các protein âm gắn vào cột và sau đó được đẩy khỏi cột bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.
Tiến hành: Gel DEAE-cellulose đã được hoạt hóa sẵn được nhồi vào cột có kích thước (1,6 x 25) cm, rửa và cân bằng cột trong đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8.
Tiếp theo hút 5 ml dịch protein đã tủa muối sau đó đưa lên cột và đẩy ra bằng đệm potasium phosphate 20 mM; pH 6,8 có chứa 1M NaCl, tốc độ dòng chảy 25ml/giờ. Thu 25 phân đoạn mỗi phân đoạn 2 ml. Các phân đoạn được xác định hàm lượng protein theo phương pháp của Braford [12]. Lựa chọn những phân đoạn có hoạt tính protein cao để xác định hoạt tính kháng nấm.
Trần Thị Thùy Linh 22 K22
Qúa trình tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm được tóm tắt theo sơ đồ hình 2.1
Hình 2.1 Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng S. marcescen DT3 2.2.5 Xác định hàm lƣợng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [12].
Nguyên tắc: protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ tạo phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với
Dịch thô
Ly tâm 12000 vòng/15 phút
Lọc qua màng lọc
Tủa 30%
ammonium sulfate
Tủa 70% ammonium sulfate
DEAE
Ly tâm 12000 vòng/15 phút
Ly tâm 12000 vòng/15 phút. Tủa thu được hòa vào đệm, loại muối bằng thẩm tích
Hoạt chất tinh sạch Thử hoạt tính kháng nấm Thử hoạt tính kháng nấm
Trần Thị Thùy Linh 23 K22
nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.2).
Tiến hành:
Ống thớ nghiệm: 100 μl dịch mẫu được bổ sung 900 àl dung dịch Bradford working. Hỗn hợp được đảo đều và so màu ở bước sóng 595 nm.
Ống đối chứng: Thay dung dịch cần định lượng protein bằng nước cất.
Hình 2.2 Đường chuẩn BSA (Sigma)
2.2.6 Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS- PAGE)
Nguyên lý: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein với nồng độ 12,5% polyacrylamide theo phương pháp điện di biến tính của Leammli và cộng sự (1970) [26]. Theo đó, các phân tử protein trong môi trường có SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
Trần Thị Thùy Linh 24 K22
Tiến hành:
Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên, cài lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn toàn và ổn định. Thành phần gel như bảng 2.5.
Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 6x với tỷ lệ mẫu/
dye là 5/1, biến tính ở 95oC, 10 phút
Điện di: Bản gel được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ dòng điện là 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy.
Bảng 2.5 Thành phần gel polyacrylamide 12,5%
STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô (ml)
1 H2O khử trùng 1,94 1,18
2 Dung dịch A 1,5
3 Dung dịch B 0,5
4 Dung dịch C 2,5 0,3
5 Dung dịch D 0,06 0,02
6 APS 0,024 0,01
7 Tedmed 0,007 0,005
2.2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm
Hoạt chất kháng nấm sau khi tinh sạch qua cột DEAE – cellulose, mẫu được ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 40oC, 50oC, 60oC, 80oC, trong thời gian 30 phút. Dịch protein sau khi sốc nhiệt được bổ sung 20 àl vào khoanh giấy lọc, mẫu đối chứng là 20 àl đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8. Các khoanh giấy được đặt vào đĩa thạch nuối cấy các
Trần Thị Thùy Linh 25 K22
chủng nấm F. oxyporum và nấm R. solani sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của nấm.
2.2.8 Ảnh hưởng của Proteinase K lên hoạt tính kháng nấm
Dịch protein sau khi tinh sạch được bổ sung proteinase K vào ở các nồng độ khác nhau như: 0,5; 1; 2; 2,5; 4,5 àg, mẫu đối chứng là 20 àl đệm potasium photphate 20 mM, pH 6,8. Sau khi được xử lý với proteinase K thỡ dịch protein được bổ sung 20 àl vào cỏc khoanh giấy lọc được đặt vào đĩa nuôi cấy chủng nấm F. oxyporum và nấm R. solani đặt vào tủ 280C nuôi sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của nấm
2.2.9 Xác định nồng độ ứng chế tối thiểu (MIC)
Protein tinh sạch được thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với nấm F.
oxyporum và R. solani bằng phương pháp ức chế theo nồng độ bổ sung. Protein tinh sạch ở cỏc nồng độ từ 10 àg/ml, 20 àg/ml, 40 àg/ml, 60 àg/ml, 80 àg/ml và 100 àg/ml được bổ sung vào các đĩa thạch PDA và xác định hoạt tính ức chế nấm F.oxyporum và nấm R.
solani theo đường tròn đồng tâm sau 3-5 ngày nuôi cấy. Đặt vào tủ 280C nuôi 3- 5 ngày kiểm tra đo đường kính ức chế sinh trưởng nấm.
2.2.10 Xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft Excel được sử dụng để xử lý số liệu thu được trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê.
Trần Thị Thùy Linh 26 K22