3.4 Tinh sạch các hoạt chất kháng nấm
3.4.3 Ảnh hưởng của proteinase K
Proteinase K là một serine protease, proteinase K thường được dùng phổ biến trong sinh học phân tử để cắt hoặc thủy phân các phân tử protein. Chúng tôi tiến hành bổ sung proteinase K vào dịch protein tinh sạch để kiểm tra xem proteinase K có làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nấm của chủng S. marcescens DT3 hay không.
Trần Thị Thùy Linh 47 K22
Dịch protein tinh sạch từ chủng S. marcescens DT3 được xử lý với proteinase K, với cỏc nồng độ từ 0,5 – 4 àg. Sau đú bổ sung 20 àl mỗi nồng độ vào khoanh giấy lọc, sau đó đặt nấm vào giữa để vào tủ 30oC sau 3- 5 ngày kiểm tra (Hình 3.21).
A
B
Hình 3.21 Ảnh hưởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxyporum (A)và nấm R.
solani (B); Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; Đ/C (+): mẫu không xử lý với proteinase K; 1: proteinase K 0,5àg; 2-7 : mẫu xử lý với proteinase K ở cỏc nồng độ: 0,5; 1; 1,5;
2; 2,5; 4 àg.
Trần Thị Thùy Linh 48 K22
Kết quả trên cho thấy những mẫu thử nghiệm khi được ủ proteinse K không ảnh hưởng đến khả năng kháng nấm F. oxyporum và R. solani của protein tinh sạch. Cụ thể khi bổ sung 50 àg protein ủ trong proteinase K ở cỏc nồng độ 0,5 àg; 1àg; 1,5àg; 2 àg;
2,5 àg; 4 àg thỡ protein vẫn cú hoạt tớnh khỏng nấm, cũn với mẫu đối chứng đệm potasium phosphate 20 mM pH6,8 thì sợi nấm vẫn phát triển bình thường.
Trong nghiên cứu này proteinase K được ủ với các protein tinh sạch ở nồng độ 0,5- 4 àg/ml. Cỏc số liệu cho thấy proteinase K khụng ảnh hưởng đến khả năng ức chế nấm F.
oxyporum và R. solani. Như vậy các protein có hoạt tính kháng nấm không bị ảnh hưởng bởi proteinase K. Có thể nguyên nhân là do các protein có hoạt tính kháng nấm đã bị thủy phân ra các dạng peptid có hoạt tính kháng nấm cùng với khối lượng phân tử nhỏ.
Chitarra và cộng sự (2003) đã công bố hợp chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng B.
subtilis YM 10-20 đã được chứng minh là không bị ức chế bởi các enzyme thủy phân bao gồm như các pronase E, proteinase K và chymotrypsin [14].
Rattanachuay và cộng sự (2010) đã công bố dịch lọc chủng Pseudomonas sp. W3 được khảo sát với enzyme proteinase K 1 mg/ml và tripsin 2 mg/ml cho thấy dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. W3 khá bền với các enzyme xử lý [37].
3.4.3 Hoạt tính ức chế nồng độ tối thiểu (MIC) của protein với nấm F. oxyporum và nấm R. solani
Từ những kết quả thu được khi tinh sạch protein, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu của hoạt chất tinh sạch thu được, cũng như thử nghiệm lại hoạt tính đối kháng với cả hai loại nấm F. oxyporum và R. solani theo phương pháp ức chế theo nồng độ bổ sung.
Trong nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch chỳng tụi bổ sung protein ở cỏc nồng độ 10 àg/ml, 20 àg/ml, 40 àg/ml, 60 àg/ml, 80 àg/ml và 100 àg/ml vào cỏc đĩa thạch PDA và xỏc định hoạt tớnh ức chế nấm F.oxyporum và nấm R. solani theo đường tròn đồng tâm sau 3-5 ngày nuôi cấy (Hình 3.22).
Trần Thị Thùy Linh 49 K22
A B
Hình 3.22 Ức chế nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng S. marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm của nấm F.oxyporum (A) và nấm R. solani (B).
Chúng tôi đã xác định khả năng ức chế nấm F.oxyporum và nấm R. solani ở nồng độ protein có hoạt tính kháng nấm được tách chiết từ chủng S. marcescens DT3 là 10 àg/ml đến 100 àg/ml. Ở nồng độ 10àg/ml, protein cú hoạt tớnh khỏng nấm này chỉ ức chế được 20% sự sinh trưởng và phát triển của nấm F.oxyporum và nấm R. solani. Khi nồng độ hoạt chất tăng lờn 60 àg/ml thỡ hoạt chất ức chế được 61% đối với nấm F.oxyporum và 40% đối với nấm R. solani. Khi tăng nồng độ hoạt chất lờn 100àg/ml thỡ hoạt chất ức chế được 80% sự sinh trưởng và phát triển của nấm F.oxyporum còn đối với nấm R. solani con số này chỉ khoẳng 50%. Điều này một lần nữa chứng tỏ rằng protein có hoạt tính kháng nấm được tách chiết từ chủng S. marcescens DT3 có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm F.oxyporum tốt hơn nấm R. solani.
Trần Thị Thùy Linh 50 K22