3.3 Nghiên cứu các điều kiện làm tăng khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng nấm
3.3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
Để sinh các hoạt chất kháng nấm với năng suất tối ưu, chủng S. marcescens DT3 được nuôi cấy trong môi trường tối ưu ở 280C và lắc 200 vòng/phút. Sau 6 giờ nuôi cấy sự sinh trưởng của tế bào bắt đầu tăng mạnh. Sau 28 giờ nuôi cấy thì sự sinh trưởng của tế bào đạt được là cao nhất (OD600nm = 5,4). Sau 48 giờ nuôi cấy thì sự sinh trưởng của tế bào bắt đầu giảm (OD600 nm = 4,3). Đến 72 giờ nuôi cấy thì sự sinh trưởng giảm mạnh và suy thoái (OD600 nm = 3,2).
Hình 3.13 Động thái sinh trưởng của chủng S. marcescens DT3 theo thời gian
Chúng tôi đã chọn sự sinh trưởng của tế bào ở 3 mốc thời gian 28 giờ, 48 giờ và 72 giờ để xác định xem thời gian sinh trưởng của tế bào có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nấm như thế nào. Sau khi tiến hành thử hoạt tính kháng nấm với 2 loại nấm F.
oxysporum và R. solani chúng tôi nhận thấy chủng S. marcescens DT3 được nuôi trong
Trần Thị Thùy Linh 39 K22
28h đã ức chế gần như hoàn toàn sự sinh trưởng của nấm R. solani và ức chế được 70%
sự sinh trưởng và phát triển của nấm F. oxysporum.
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian lên sự ức chế sinh trưởng của nấm F. oxysporum và R. solani
ĐC 28h 48h 72h
A
ĐC 28h 48h 72h
B
Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian lên sự ức chế sinh trưởng của nấm F. oxysporum (A) và nấm R. solani (B)
Thời gian Nấm F. oxysporum Nấm R. solani
sinh trưởng của nấm ( Φ:cm)
Hoạt tính ức chế (%)
sinh trưởng của nấm ( Φ:cm)
Hoạt tính ức chế
(%)
0 9 0 9 0
28h 2,6 ± 0,2 71 ± 2,2 1 ± 0,2 89 ± 2
48h 7 ± 0,27 22 ± 3 2,5 ± 0,15 72 ± 1,6
72h 7,5 ± 0,15 17 ± 1,6 8 ± 0,15 11 ± 1,6
Trần Thị Thùy Linh 40 K22
3.3.2.2 pH môi trường ban đầu
Giá trị pH của dịch nuôi có một tầm quan trọng trong quá trình sinh trưởng và tổng hợp các hoạt chất kháng nấm của S. marcescens DT3. Chủng S. marcescens DT3 được nuôi cấy trong môi trường LB tối ưu được điều chỉnh pH ở 3 mức là 5, 7, 9 ở 280C lắc 200 vòng/phút. Sau 28 giờ nuôi cấy dịch lên men chủng S. marcescens DT3 được ly tâm 12000 vòng/15 phút ở 40C. Thu dịch chiết ngoại bào rồi lọc vô trùng qua màng lọc cú kớch thước lỗ 0,20 àm. Dịch chiết ngoại bào được thử hoạt tớnh khỏng nấm và kết quả thu được là chủng S. marcescens DT3 được nuôi trong môi trường LB tối ưu có pH =7 cho hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani mạnh hơn so với chủng S.
marcescens DT3 được nuôi trong môi trường LB tối ưu có pH là 5 và pH là 9.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH lên sự ức chế sinh trưởng của nấm F. oxysporum và nấm R.
solani
ĐC pH = 5 pH = 7 pH = 9
A
pH Nấm F. Oxysporum Nấm R. solani
sinh trưởng của nấm ( Φ:cm)
Hoạt tính ức chế (%)
sinh trưởng của nấm ( Φ:cm)
Hoạt tính ức chế (%)
ĐC 9 0 9 0
pH=5 6±0,3 33±3,3% 2,5±0,3 72±3,3
pH=7 3±0,25 67±2,7 1,5±0,2 83±2,2
pH=9 8±0,15 11±1,6 3±0,1 67±1,1
Trần Thị Thùy Linh 41 K22
ĐC pH = 5 pH = 7 pH = 9
B
Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH lên sự ức chế sinh trưởng của nấm F. oxysporum (A) và nấm R.
solani (B)
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp rất nhiều nghiên cứu trên thế giới khi nuôi chủng S. marcescens DT3 trong môi trường có pH=7. Năm 2011 Jin và cộng sự đã nuôi cấy chủng S. marcescens XJ-01 trong môi trường LB có pH là 7 [23]. Zarei và cộng sự đã sử dụng môi trường có pH là 7,5 để nuôi chủng S. marcescens B4A tách chiết được chitinase có khả năng kháng lại một số chủng nấm như Bipolaris sp và Alternaria brassicicola [44].
Tuy nhiên trên thế giới với các chủng S. marcescens khác nhau thì pH của môi trường nuôi cấy cũng có sự khác nhau. Năm 2011 Parani và cộng sự lại sử dụng môi trường có pH là 5 để nuôi chủng S. marcescens RS1. Chỉ cần bổ sung 1 ml dịch lọc vào môi trường nuôi cấy các nấm Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Alternaria alternate đã ức chế được 60% đến 73% sự phát triển của các nấm tương ứng còn khi tăng lên từ 3 – 5 ml dịch lọc thì đã ức chế 85% đến 93% sự phát triển của các nấm [34].
Sau khi tối ưu được các điều kiện và thành phần môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng nấm từ chủng S. marcescens DT3. Chúng tôi tiến hành so sánh hoạt tính kháng nấm từ dịch chiết của chủng S. marcescens DT3 được nuôi trong hai môi trường trước và sau tối ưu. Chủng S. marcescens DT3 được nuôi trong môi trường trước tối ưu NA bao gồm các thành phần: và môi trường sau tối ưu LB với các thành phần 1,25% pepton, 1% NaCl, 0,5% cao nấm men, pH 7,0, thời gian nuôi cấy 28
Trần Thị Thùy Linh 42 K22
giờ. Kết quả trên hình 3.16 cho thấy đối với nấm F. oxyporum, hoạt tính kháng nấm tăng 2,6 lần so với môi trường trước tối ưu và 15 lần đối với nấm R. solani.
Hình 3.16 Hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani của chủng S. marcescens DT3 trước và sau khi tôi ưu