Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Thu nhận hồ sơ ADN (cả mtADN và nADN) từ xương thường gặp nhiều khó khăn do nguồn ADN tách chiết thường đã bị thoái hóa mạnh, số lượng ít và sự hiện diện của nhiều chất ức chế PCR. Một phương pháp tách chiết ADN từ xương tối ưu sẽ đồng thời phục hồi lượng ADN lớn nhất và loại bỏ tốt nhất các yếu tố ức chế PCR.
Các qui trình tách chiết ADN còn lại từ xương rất khác nhau, có hai phương pháp thông thường thường được sử dụng gồm có: tách hữu cơ (sử dụng phenol/chloroform) và tách vô cơ (silica hoặc hạt từ). Phương pháp hữu cơ có hiệu quả trong việc loại bỏ các protein và chất béo từ dịch chiết ADN, tuy nhiên nó lại không hiệu quả đối với việc loại bỏ các chất ức chế PCR như acid humic đồng thời nó tốn thời gian, thao tác phức tạp và các dung môi sử dụng độc hại. Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu và các hãng thương mại đã nỗ lực phát triển các phương pháp khai thác vô cơ. Đa số các phương pháp này sử dụng các khả năng hấp thụ thuận nghịch của silica hoặc hạt lõi từ đối với các phân tử ADN dựa trên nồng độ muối.
Từ lâu, tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được nhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu. Bảng 1.1 trình bày tổng hợp các qui trình tách chiết ADN từ xương lâu năm và xương cổ đại đã được công bố.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 20
Bảng 1.1: Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được công bố trên thế giới
Tác giả Mẫu hài cốt
Phương pháp tách chiết ADN
Chỉ thị
phân tử Kết quả
Kurosaki và cộng sự (1993) [28]
Các mẫu hài cốt người được lấy ở Nhật Bản, từ thế kỉ 1 đến thế kỉ 5
Sử dụng EDTA để loại khoáng có trong xương.
Tách chiết bằng
phenol/chloroform/isoamyl alcohol, ethanol dùng để tủa ADN.
Tinh sạch bằng cột silica.
Trình tự lặp lại ngắn (Short- VNTR)
Thu được kiểu gen Short- VNTR của mỗi cá thể Khi nhân bội ADN từ xương thất bại thì kiểu gen sẽ được xác định bằng cách lấy từ một chiếc răng hoặc lấy thêm xương
Cattaneo và cộng sự (1995) [11]
Xương mới của người Hài cốt người đã chết từ 3-9 tháng
Kết tủa protein bằng muối sodium acetate, tủa ADN bằng isopropanol
Dùng Phenol/chloroform để tách chiết, tủa ADN bằng ethanol.
Nhân bội nADN
Không nhân bội đuợc một số xương khi dùng phenol/chloroform để tách chiết và tủa ADN bằng ethanol
Nhân bội thành công khi tủa protein bằng muối sodium acetate và tủa ADN bằng isopropanol
Yang và cộng sự (1998) [52]
Hài cốt người đã chết từ 15- 5000 năm
Dùng EDTA để loại khoáng có trong xương, tách chiết bằng phenol/chloroform, sử dụng cột để cô mẫu
Sử dụng EDTA loại khoáng trong xương, tách chiết bằng
phenol/chloroform, cột cô mẫu, cột silica để tinh sạch
Loại khoáng trong xương bằng EDTA, dung dịch phân giải proteinase K được cho trực tiếp vào cột cô mẫu và/ hoặc cột silica
Nhân bội nADN
Nhân bội được khi tách chiết bằng
phenol/chloroform, cột cô mẫu, cột silica để tinh sạch
PCR bị ức chế khi không sử dụng cột silica cho việc tách chiết xương bằng phenol/chloroform Nhân bội được khi dung dịch phân giải proteinase K được thêm vào cột cô mẫu và/ hoặc cột silica
Kalmár và cộng sự (2000) [22]
Các mẫu hài cốt ở nghĩa trang Hungary, từ thế kỷ 7- thế kỷ 15.
Dùng sodium acetate và ethanol để tủa ADN từ dịch nổi của dịch phân giải bột xương
Dùng EDTA loại khoáng trong xương, tách chiết bằng
phenol/chloroform, tủa ADN bởi isopropanol
Giải trình tự
mtADN
Thu được trình tự hoàn thiện của ADN ty thể khi sử dụng sodium
acetate/ethanol để tủa ADN
Không nhân bội được khi tách chiết bằng
phenol/chloroform và tủa bằng isopropanol
Loreille và cộng sự (2007) [30]
Các mẫu hài cốt người đã chết từ 14-
Tách chiết bằng
phenol/chloroform, cột cô mẫu EDTA dùng để hòa tan hoàn toàn bột xương,
Chạy qPCR đối với ADN ty thể
Từ các mẫu hài cốt bị mủn, kém chất lượng thì sự hòa tan hoàn toàn bột xương giúp cho ADN
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 21
100 năm phenol/chloroform/isoamyl alcohol dùng cho tách chiết, cột cô mẫu
Nhân bội STR
được thu hồi tăng lên đáng kể và số lượng allen thu được của STR cũng tăng lên
Nelson và Melton 2007 [33]
Các mẫu hài cốt (các trường hợp xác định danh tính trong pháp y và các trường hợp lịch sử)
Tách chiết bằng silica
Giải trình tự ADN ty thể
83% trường hợp thu được 1 phần trình tự ADN ty thể
Thất bại khi tách chiết ADN từ những xương bị cháy
Những trường hợp lịch sử ít có khả năng cho trình tự ADN ty thể đầy đủ
Rohland và Hofreiter (2007) [42]
Các mẫu hài cốt của một hang gấu, ở kỉ Pleistocene ( cách đây hơn 20.000 năm)
Dùng EDTA loại khoáng trong xương, tách chiết bằng
phenol/chloroform, cột cô mẫu Tách chiết cơ bản bằng Kit silica Tách chiết dựa vào Kit hạt từ silica
Dùng EDTA loại khoáng trong xương, tách chiết bằng silica;
ngoài ra còn tối ưu hóa phương pháp này
Chạy qPCR đối với ADN ty thể
Không có sự khác biệt đáng kể về lượng ADN thu được giữa phương pháp có khả năng thu hồi ADN cao nhất (kit dựa trên hạt silica có từ tính) và các phương pháp khác Tối ưu hóa loại khoáng/
tách chiết bằng silica làm tăng chất lượng ADN lên gấp 2 lần
Bổ sung thêm các chất tẩy rửa không cải thiện được chất lượng ADN Bổ sung EDTA và protein K làm tăng chất lượng ADN
Kim và cộng sự (2008) [25]
Mẫu hài cốt người mà trước đây khi nhân bội ADN bị thất bại, mẫu có tuổi từ 500- 3300 năm
Loại khoáng bằng EDTA, silica dùng để tách chiết
Loại khoáng bằng EDTA, silica dùng để tách chiết, cột trao đổi ion, cột cô mẫu
Nhân bội ADN ty thể Nhân bội nADN ( locus giới tính)
Đa số các xương nhân bội thành công ADN ty thể, 4 trong 9 xương nhân bội được locus giới tính khi sử dụng silica tách chiết
Khi tách chiết với silica và cột trao đổi ion thì tất cả các xương đều nhân bội thành công ADN ty thể và locus giới tính Coticone
và cộng sự (2010) [12]
Các mẫu xương lợn Các mẫu xương người
Xử lý mẫu bằng siêu âm, sodium chloride để tủa protein, ethanol tủa ADN, tinh sạch bằng hạt silica
Nhân bội STR (người) Nhân bội 1 locus
Tách chiết ADN thành công khi sử dụng song siêu âm để xử lý mẫu Lên đầy đủ NADN ở các mẫu xương người
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 22
của STR (lợn)
Lee và cộng sự (2010) [19]
Các hài cốt người từ chiến tranh Hàn Quốc
Kit Silica
Sử dụng EDTA để hòa tan hoàn toàn bột xương, Kit silica
Nhân bội STR
Tỉ lệ khôi phục ADN genomic thấp(< 51%) Nồng độ mùn cao làm ảnh hưởng đến chất lượng ADN
Hòa tan hoàn toàn bột xương làm tăng số lượng allen của STR
Sylvain Amory và cộng sự (2012) [46]
Khai quật hài cốt người chết từ năm 1992 đến 1999
Dùng EDTA hòa tan hoàn toàn bột xương, cột cô mẫu, cột silica để tinh sạch
Dùng Kit silica tách chiết với một số thay đổi, cột cô mẫu
Chạy qPCR đối với nADN Nhân bội STR
Hòa tan hoàn toàn bột xương đã cải thiện được chất lượng của STR và số lượng ADN được hồi phục
Protocol bao gồm cả quá trình hòa tan được tiến hành tự động trên hệ thống QIAcube
Dukes và cộng sự (2012) [14]
Khôi phục lại những hài cốt người không nhận dạng được năm 2000, 2006 và không rõ thời gian
Tối ưu hóa thể tích phản ứng, dung dịch phân giải,và thời gian ủ mẫu đối với phương pháp Tách chiết tự động sử dụng hạt từ phủ silica
Định lượng nADN Nhân bội STR
Với việc tối ưu hóa phương pháp đã thu được đầy đủ hồ sơ STR từ xương được tách chiết;
một phần hồ sơ STR khi trước đây sử dụng protocol này đã được tác giả công bố
Rucinski và cộng sự (2012) [43]
Khai quật các bộ hài cốt người được chôn từ 6-118 tháng
Tách chiết bằng Kit silica, cột cô mẫu
Sử dụng EDTA để loại khoáng trong xương, tách chiết bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol, cột cô mẫu
Định lượng nADN Nhân bội STR
Tách chiết với
phenol/chloroform giúp ADN phục hồi tốt hơn Tách chiết bằng phenol/chloroform cho đầy đủ hồ sơ STR; sử dụng Kit tách chiết Silica thì số allen nhân bội được ít hơn.
Có thể thấy rằng không có sự đồng thuận về một phương pháp tách chiết ADN tối ưu cho xương lâu năm. Không chỉ bất đồng về phương pháp tách chiết, từng bước trong mỗi qui trình tách chiết cũng khác nhau tùy theo mỗi nhóm tác giả.
Ví dụ như bước loại can xi có nhóm tác giả cho rằng cần thiết phải tiến hành trong thời gian dài nhưng cũng có ý kiến cho rằng bước này sẽ làm mất lượng lớn ADN,
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 23
nếu kéo dài sẽ làm tăng khả năng mất hoặc phân hủy ADN, giảm hiệu suất tách chiết…
1.5. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN để xác định cá thể người đã được bắt đầu vào cuối những năm 90 của thế kỷ 20 và đã có những bước phát triển nhất định.
* Năm 2003, Viện Pháp Y quân đội phối hợp với Viện Công nghệ sinh học thực hiện đề tài khoa học cấp nhà nước "Nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN trong việc xác định hài cốt liệt sĩ" có mã số KC.04.23. Hiện nay, công nghệ giám định gen trên ADN ti thể đã được ứng dụng trong thực tiễn tại Việt Nam, với hàng trăm trường hợp được xác định thành công [2].
* Mô ̣t số trung tâm, công ty có di ̣ch vu ̣ phân tı́ch di truyền cũng có thể đáp ứng những yêu cầu phân tı́ch giám định ADN ti thể từ xương lâu năm.
Như vậy, việc giám định các mẫu xương sử dụng hệ gen ti thể đã được tiến hành từ lâu và thu được nhiều kết quả. Tuy nhiên, đến thời điểm hiện tại, chưa có
mô ̣t cơ sở nghiên cứu nào tiến hành các phân tı́ch ADN đối với hệ gen nhân trên mẫu xương lâu năm. Phương pháp phân tı́ch ADN ti thể, mă ̣c dù có nhiều kết quả
khả quan, nhưng chı̉ cho phép xác định được quan hệ di truyền theo dòng mẹ mà không có khả năng truy nguyên đến cá thể. Trong khi đó, viê ̣c phân tı́ch nADN từ xương lâu năm có thể cho phép truy nguyên tới tâ ̣n cá thể với mức độ chính xác cao khi có thêm các mẫu liên quan như mẫu có quan hệ huyết thống trực tiếp, mẫu của anh em trai theo dòng cha hoặc khi có cơ sở dữ liệu ADN để đối chiếu so sánh trực tiếp. Đây là một yêu cầu thiết yếu trong giám định hình sự. Hơn nữa, tại Việt Nam, nhu cầu giám định hài cốt rất lớn, số lượng mẫu cần giám định hàng năm lên tới hàng trăm mẫu.
Tìm hiểu về tình hình giám định ADN phục vụ mục đích truy nguyên cá thể từ các mẫu đã bị phân hủy mạnh, đặc biệt là các hài cốt, chúng tôi nhận thấy có một số điểm cần lưu ý sau:
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 24
1. Có một nhu cầu lớn về phân tích, giám định ADN nhằm định danh, truy nguyên cá thể. Đó có thể là những trường hợp nhận dạng cá nhân đơn lẻ trong các mẫu hình sự hoặc nhu cầu truy tìm nhân thân, cũng có khi là các trường hợp cần phân tích số lượng lớn như mẫu hài cốt liệt sĩ trong chiến tranh hoặc mẫu nạn nhân từ những thảm họa hàng loạt.
2. Trong truy nguyên cá thể hiện nay các phân tích STR nằm trên NST thường vẫn là các phân tích cho kết quả có giá trị nhất.
3. Trong phân tích ADN nhân từ xương thì bước tách chiết ADN để thu nhận được một lượng ADN tinh sạch và đủ chất lượng cho các phân tích chỉ thị di truyền tiếp theo. Tuy nhiên chưa có một phương pháp tách chiết chung nào cho tách chiết xương lâu năm.
4. Ở Việt Nam, phân tích ADN xương lâu năm đã được tiến hành từ lâu nhưng chủ yếu sử dụng phân tích mtADN.
Từ phân tích trên, chúng tôi xác định mục tiêu đặt ra của đề tài luận văn là:
Tối ưu được qui trình tách ADN tổng số từ xương lâu năm phục vụ nhận dạng cá thể người phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Tối ưu các bước xử lý mẫu, loại can xi
- Thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu tại điều kiện phòng thí nghiệm
- Tối ưu qui trình tách chiết, phân tích nADN từ xương lâu năm; thực hiện phân tích với các mẫu thu thập theo qui trình đã xây dựng.