3.2. Kết quả thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu tại điều kiện phòng thí nghiệm
3.2.1. Kết quả phân tích, xác định kiểu gen
Khuôn ADN sau tách chiết được định lượng bằng phương pháp đo OD trên máy NanoDrop. Chỉ số A260/280 của các khuôn ADN sau tách chiết bằng 03 phương pháp như sau:
Bảng 3.3. Kết quả đo OD các mẫu khuôn sau tách chiết bằng 03 phương pháp TT Mã số Loại mẫu Tỉ số A260/280 của các phương pháp
tách chiết
PCI INV IQS
1. ĐT-12-X01 Xương đùi 1,65 1,72 1,77
2. ĐT-12-X02 Xương đùi 1,65 1,76 1,75
3. ĐT-12-X03 Răng hàm 1,52 1,70 1,68
4. ĐT-12-X04 Răng hàm 1,60 1,70 1,70
5. ĐT-12-X05 Răng hàm 1,50 1,62 1,68
6. ĐT-12-X10 Răng hàm 1,63 1,72 1,72
7. ĐT-12-X11 Xương đùi 1,48 1,49 1,60
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 39
8. ĐT-12-X16 Xương đùi 1,48 1,71 1,77
9. ĐT-12-X22 Răng hàm 1,50 1,53 1,58
10. ĐT-12-X26 Xương đùi 1,51 1,50 1,60
10 àl ADN khuụn sau khi tỏch chiết từ 10 mẫu bằng 3 phương phỏp nờu trờn được sử dụng để thực hiện PCR phân tích kiểu gen STR của 16 locus theo bộ KIT PowerPlex®16 HS.
Bảng 3.4: Kết quả phân tích ADN các locus STR trên các mẫu hài cốt được tách chiết bằng 03 phương pháp khác nhau
TT Mã số Loại mẫu
Số locus xác định được kiểu gen Phương
pháp PCI
Phương pháp INV
Phương pháp IQS
1. ĐT-12-X01 Xương đùi 5/16 8/16 11/16
2. ĐT-12-X02 Xương đùi 4/16 9/16 12/16
3. ĐT-12-X03 Răng hàm 0/16 5/16 5/16
4. ĐT-12-X04 Răng hàm 2/16 4/16 8/16
5. ĐT-12-X05 Răng hàm 0/16 0/16 4/16
6. ĐT-12-X10 Răng hàm 2/16 7/16 7/16
7. ĐT-12-X11 Xương đùi 0/16 0/16 0/16
8. ĐT-12-X16 Xương đùi 0/16 5/16 8/16
9. ĐT-12-X22 Răng hàm 0/16 1/16 0/16
10. ĐT-12-X26 Xương đùi 0/16 0/16 0/16
11. ĐC (+) TC Móng tay 16/16 16/16 16/16
12. ĐC (-) TC - - - -
13. ĐC (+) PCR K562 16/16 16/16 16/16
14. ĐC (-) PCR ddH20 - - -
15.
Kết quả phân tích (hình ảnh điện di đồ và bảng kết quả kiểu gen các locus STR) được thể hiện ở phụ lục 3.
3.2.2. Kết quả đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết
Việc đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết được thực hiện trên các tiêu chí được đặt ra bao gồm:
(1) Hiệu suất tách chiết: Phương pháp tách chiết ADN có hiệu suất cao nhất là phương pháp cho kết quả xác định được kiểu gen (hồ sơ ADN) của một mẫu đầy đủ nhất.
(2) Khả năng nhiễm mẫu và tự động hóa: Phương pháp tách chiết càng đơn giản, ít thao tác và có khả năng tự động hóa sẽ cho khả năng chống nhiễm cao vì sẽ giảm thiểu sự tiếp xúc của người làm với mẫu phân tích.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 40
(3) Tính độc hại với người sử dụng: tính độc hại của các hóa chất tách chiết với người sử dụng
Với các tiêu chí đã nêu, sau khi thử nghiệm 03 phương pháp tách chiết, chúng tôi đã lựa chọn được phương pháp hiệu quả và phù hợp với điều kiện PTN của của chúng tôi việc đánh giá các tiêu chí như sau:
* Về hiệu quả sử dụng: phương pháp IQS cho kết quả kiểu gen các locus STR đầy đủ hơn hai phương pháp PCI và INV đối với cả 10 mẫu thí nghiệm thể hiện qua: số lượng locus dương tính nhiều hơn, alen phân tích được có độ cao của peak (đỉnh tín hiệu huỳnh quang) lớn hơn (phụ lục 3).
* Về khả năng nhiễm mẫu và tính tự động hoá:
Phương pháp IQS hiện nay có thể phát triển tự động hoá trên hệ thống máy tách chiết tự động của Promega, do đó sẽ có khả năng tăng năng suất phân tích và tránh nhiễm mẫu. Điều này đặc biệt quan trọng đối với mẫu hài cốt lâu năm. Hai phương pháp còn lại hiện nay chưa có báo cáo về khả năng tách chiết trên hệ thống tự động.
* Về tính độc hại đối với người sử dụng: phương pháp PCI có sử dụng các dung môi hữu cơ (phenol, chloroform, isoamylacolhol) nên gây độc hại cho người sử dụng hơn hai phương pháp IQS và INV.
Dựa vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọn bộ KIT DNA IQTM System của Promega (IQS).
3.3. Kết quả tối ưu qui trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm
Nhằm mục đích thu được kết quả tốt hơn chúng tôi đã tiến hành cải tiến một số bước trong qui trình tách chiết của bộ Kit IQS để phù hợp với các mẫu xương lâu năm ở Việt Nam được chôn trong điều kiện khí hậu nóng ẩm.
ADN trong các hài cốt lâu năm ở Việt Nam bị phân hủy nhiều, chất lượng kém hơn so với mẫu chuẩn của Kit nên chúng tôi quyết định tăng lượng bột xương đầu vào lên 2 g, dung dịch phân giải (digeston solution) lên 4 ml. Chính vì thế, sau khi ủ, thể tích dịch ủ thu được gấp 4 lần so với qui trình chuẩn của hãng. Để giải
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 41
quyết vấn đề này, chúng tôi sử dụng cột cô mẫu Amicon với mục đích thu được lượng dịch chuẩn, để có thể tiếp tục thực hiện các bước tách chiết tiếp theo.
Nhận thấy sau khi thay đổi một số bước trong qui trình tách chiết của Kit IQS chúng tôi đã thu được kết quả khả quan hơn đối với 10 mẫu thử nghiệm. Khuôn ADN sau khi tách chiết của các mẫu có độ sạch cao hơn (tỷ lệ A260/280 trung bình của các mẫu đạt 1,81), số locus xác định được kiểu gen cũng nhiều hơn
Bảng 3.5: So sánh kết quả khi tách chiết bằng Kit IQS và IQS có cải tiến
TT Mã số
Tỷ lệ A260/280 Số locus xác định được Nhà sản
xuất
Quy trình cải tiến
Nhà sản xuất
Quy trình cải tiến
1 ĐT-12-X01 1,77 1,83 11/16 12/16
2 ĐT-12-X02 1,75 1,78 12/16 12/16
3 ĐT-12-X03 1,68 1,70 5/16 7/16
4 ĐT-12-X04 1,70 1,70 8/16 9/16
5 ĐT-12-X05 1,68 1,69 4/16 4/16
6 ĐT-12-X10 1,72 1,81 7/16 7/16
7 ĐT-12-X11 1,60 1,70 1/16 1/16
8 ĐT-12-X16 1,77 1,79 8/16 8/16
9 ĐT-12-X22 1,58 1,70 0/16 3/16
10 ĐT-12-X26 1,60 1,64 0/16 2/16
Có 5/10 mẫu cho hồ sơ ADN đầy đủ hơn. Cụ thể : mẫu ĐT-12-X01 lên thêm locus TPOX, mẫu ĐT-12-X03 thêm 2 locus D3S1358 và TH01, mẫu ĐT-12-X04 thêm locus D3S1358, mẫu ĐT-12-X22 lên 3 locus mới D3S1358, TH01 và vWA, mẫu ĐT-12-X26 lên 2 locus mới là TH01 và D5S818. Kết quả này được thể hiện rõ ở hình 3.1
Mẫu ĐT-12- X01 khi tách theo kit IQS
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 42
Mẫu ĐT-12- X03 khi tách theo kit IQS
Mẫu ĐT-12- X03 khi tách theo kit IQS có cải tiến Mẫu ĐT-12- X03 khi tách theo kit IQS có cải tiến
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 43
Mẫu ĐT-12-X04 Mẫu ĐT-12- X04 khi tách theo kit IQS có cải tiến
Mẫu ĐT-12- X22 khi tách theo kit IQS Mẫu ĐT-12- X22 khi tách theo kit IQS
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 44
Hình 3.1: Kết quả so sánh một số mẫu khi tách theo kit IQS của nhà sản xuất và theo quy trình cải tiến
Mẫu ĐT-12- X26 khi tách theo kit IQS có cải tiến Mẫu ĐT-12- X26 khi tách theo kit IQS
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 45
Như vậy, qui trình tách chiết cuối cùng chúng tôi lựa chọn là qui trình theo Kit IQS cải tiến. Để thử nghiệm qui trình: chúng tôi đã gửi qui trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm tới thử nghiệm tại Viện Pháp Y Quân Đội. Kết quả thử nghiệm được kết luận chung như sau: “Qui trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm do P3 - H57 nghiên cứu xây dựng ổn định, có hiệu quả cao, có thể áp dụng trong phân tích ADN nhân từ xương lâu năm, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam”. Toàn bộ qui trình tổng quát để tách chiết và phân tích nADN từ xương lâu năm được chúng tôi xây dựng và mô tả qua sơ đồ sau:
Hình 3.2: Sơ đồ mô tả qui trình tổng quát tách chiết, phân tích ADN từ xương lâu năm
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 46
3.4. Kết quả phân tích ADN nhân các mẫu xương theo qui trình đã xây dựng Áp dụng qui trình phân tích đã xây dựng, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm phân tích ADN trên các mẫu xương lâu năm đã thu của đề tài.
Số lượng mẫu xương phân tích còn lại là 40 mẫu, lượng bột xương sử dụng cho mỗi mẫu là 2 g. Kết quả cho thấy có 23/40 mẫu cho kết quả phân tích kiểu gen 16 locus STR, với số locus phân tích được là từ 1 đến 12 locus.
Kết hợp với 10/10 mẫu đã cho kết quả phân tích kiểu gen STR (khi thử nghiệm lựa chọn phương pháp tách chiết IQS cải tiến - Bảng 3.5). Tổng số mẫu phân tích được kiểu gen các locut STR (hệ Power Plex 16) là 33 mẫu. Đặc điểm về mẫu và kiểu gen phân tích được trình bày lần lượt ở bảng 3.6 và bảng 3.7.
Bảng 3.6. Sơ bộ các đặc điểm của 33 mẫu phân tích thành công ADN nhân STT Mã số mẫu Loại mẫu
(*)
Chất lượng mẫu (**)
Kết quả đo OD khuôn ADN
tổng số
Kết quả phân tích STR
1. ĐT-12-X01 XO T 1,65
11/16
2. ĐT-12-X02 XO T 1,49
12/16
3. ĐT-12-X03 RH T 1,85
5/16
4. ĐT-12-X04 RH T 1,52
8/16
5. ĐT-12-X05 RH T 1,78
4/16
6. ĐT-12-X10 RH T 1,75
7/16
7. ĐT-12-X11 XĐ T 1,70 1/16
8. ĐT-12-X12 RH PHN 1,45 6/16
9. ĐT-12-X16 XO T 1,63 8/16
10. ĐT-12-X18 RH PHN 1,50 7/16
11. ĐT-12-X22 RH T 1,70 3/16
12. ĐT-12-X24 RH PHN 1,47 8/16
13. ĐT-12-X26 XO T 1`,64 2/16
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 47
STT Mã số mẫu Loại mẫu (*)
Chất lượng mẫu (**)
Kết quả đo OD khuôn ADN
tổng số
Kết quả phân tích STR
14. ĐT-12-X29 RH T 1,51 6/16
15. ĐT-12-X30 RH T 1,51 6/16
16. ĐT-12-X34 XO T 1,45 8/16
17. ĐT-12-X38 RH T 1,39 6/16
18. ĐT-12-X39 RH PHN 1,42 4/16
19. ĐT-12-X43 XO T 1,40 6/16
20. ĐT-12-X46 RH T 1,42 5/16
21. ĐT-12-X48 RH T 1,39 6/16
22. ĐT-12-X50 RH PHN 1,46 4/16
23. ĐT-12-X54 RH T 1,45 4/16
24. ĐT-12-X62 RH PHN 1,46 6/16
25. ĐT-12-X65 RH T 1,44 10/16
26. ĐT-12-X71 RH T 1,45 6/16
27. ĐT-12-X74 RH PHN 1,46 1/16
28. ĐT-12-X77 XO PHN 1,46 3/16
29. ĐT-12-X81 RH T 1,45 3/16
30. ĐT-12-X85 RH PHN 1,47 2/16
31. ĐT-12-X88 RH T 1,47 5/16
32. ĐT-12-X93 RH T 1,40 12/16
33. ĐT-12-X94 RH T 1,40 13/16
(*) XO: Mẫu xương ống; RH: Mẫu răng hàm (**) T: Mẫu tốt; PHN: mẫu phân hủy nhẹ.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 48
Bảng 3.7: Kết quả kiểu gen các locus STR 33 mẫu xương lâu năm
TT Mã số mẫu
D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D Ame vWA D8S1179 TPOX FGA
1. ĐT-12-X01 15-16 7-9 31-32.2 16-17 - 7-11 8-9 12-13 10-13 - - X-Y 16-17 11-12 - - 2. ĐT-12-X02 15-16 7-9 30-31 14-15 - 10-13 8-12 8-8 9-11 - - X-Y 14-16 14-18 8-8 -
3. ĐT-12-X03 - - 29-32.2 16-20 - 10-13 - 10-11 - - - - 14-14 - - -
4. ĐT-12-X04 - 7-9 30-33.2 - - 10-11 9-11 8-11 - - - X-Y 16-18 8-9 - -
5. ĐT-12-X05 18-18 9-9 - - - - - 8-8 - - - - 14-14 - - -
6. ĐT-12-X10 - - 30-32.2 12-16 - 11-11 - 11-12 - - - X-Y 15-18 13-14 - -
7. ĐT-12-X11 15-17 - - - - - - - - - - - - - - -
8. ĐT-12-X12 - 7-9 29-32.2 - - 10-13 - 9.1-11 - 10-12 - - - 10-17 - -
9. ĐT-12-X16 16-16 9-9.3 30-31 11-14 - 10-11 - 11-12 - - - - 17-17 10-10 - -
10. ĐT-12-X18 16-16 7-9 - - - 10-11 8-12 9-11 - - - - 15-18 10-15 - -
11. ĐT-12-X22 16-18 6-7 - - - - - - - - - - 16-16 - - -
12. ĐT-12-X24 16-16 9-9.3 30-31 - - 10-11 - 11-12 - - - X-Y - 10-10 11-11 -
13. ĐT-12-X26 - 7-7 - - - 11-12 - - - - - - - - - -
14. ĐT-12-X29 - 7-9.3 32.2-32.2 - - 10-13 - 10-12 - - - X-Y - 11-12 - -
15. ĐT-12-X30 16-17 6-7 - - - 12-12 - 9-12 - - - - 14-16 12-13 - -
16. ĐT-12-X34 16-17 7-10 29-30 - - 10-12 - 10-10 - - - X-Y 16-18 14-16 - -
17. ĐT-12-X38 16-17 - 28-30 - - 7-7 - 9-10 - - - X-Y - 10-12 - -
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 49
TT Mã số mẫu
D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E D5S818 D13S317 D7S820 D16S519 CSF1PO Penta D Ame vWA D8S1179 TPOX FGA
18. ĐT-12-X39 16-17 - - - - - 8-10 - - - - - 14-18 10-13 - -
19. ĐT-12-X43 - 7-8 29-32 - - 11-12 - 10-11 - - - X-Y - 11-12 - -
20. ĐT-12-X46 - 9-10 - - - 11-11 - 8-12 - - - X-Y - 11-13 - -
21. ĐT-12-X48 - 6-7 - 13-16 - 10-10 - 8-11 - - - X-Y - 13-15 - -
22. ĐT-12-X50 - - 31.2-33.2 - - 11-13 - - - - - X-Y - 13-14 - -
23. ĐT-12-X54 16-18 - - - - 10-12 - 10-12 - - - - - 11-14 - -
24. ĐT-12-X62 17-17 7-10 - - - 7-11 - 10-13 - - - X-Y - 13-15 - -
25. ĐT-12-X65 15-15 6-7 30-31 - - 11-12 10-12 11-11 - - - X-X 18-20 11-15 8-9 -
26. ĐT-12-X71 - 7-9.3 - 15-19 - 10-13 - 10-12 - - - X-Y - 11-12 - -
27. ĐT-12-X74 - 8-9 - - - - - - - - - - - - - -
28. ĐT-12-X77 - - - - - 11-13 - - - - - X-Y 14-18 - - -
29. ĐT-12-X81 - 7-9 - - - 10-11 - - - - - X-Y - - - -
30. ĐT-12-X85 - - 29-29 - - 10-11 - - - - - - - - - -
31. ĐT-12-X88 15-16 - - - - 10-11 10-10 8-8 - - - - 14-18 - - -
32. ĐT-12-X93 16-16 7-9 30-32.2 - - 10-11 8-8 9-9 10-11 9-10 - X-X 17-17 11-15 8-8 - 33. ĐT-12-X94 15-17 6-7 29-31.2 12-19 - 10-11 9-12 12-12 11-12 11-12 - X-X 19-19 13-15 8-9 -
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 50
Kết quả của chúng tôi cho thấy tỷ lệ phân tích thành công kiểu gen STR các mẫu hài cốt lâu năm là 66% (33/50 mẫu).
Từ kết quả thu được (bảng 3.6), chúng tôi nhận thấy tỷ lệ thành công đối với việc thu được một hồ sơ ADN đầy đủ (16 locus) là một thách thức lớn đối với mẫu xương lâu năm tại Việt Nam. Trong tổng số 50 mẫu phân tích, số mẫu thu được kết quả 9 -12 locus STR là 05 mẫu (chiếm 10%), số mẫu thu được kết quả từ 3 - 8 locus STR là 24 mẫu (chiếm 48%).
Những mẫu xác định được kiểu gen STR trên 9 locus sẽ cho khả năng cao trong việc xác định độ tin cậy khi so sánh với hồ sơ ADN của mẫu cần đối chiếu (mẫu thân nhân, mẫu nghi ngờ...) trong trường hợp hai hồ sơ ADN có sự trùng hợp.
Còn đối với những mẫu xác định được kiểu gen STR trên 3 locus, tuy không đạt được độ tin cậy cao trong trường hợp so sánh khẳng định sự trùng hợp nhưng lại đặc biệt có ý nghĩa khi sử dụng để loại trừ mối quan hệ (đối với trường hợp mẫu phân tích và mẫu đối chiếu không trùng hợp) bởi vì chỉ cần có sự khác biệt ở 2 locus STR là đã có thể cho phép loại trừ. Trong thực tế, để đi đến một kết luận trong một vụ án hay một qui trình phân tích xác định mối quan hệ thân nhân, người giám định viên luôn phải kết hợp cùng lúc nhiều thông tin khác nhau, trong đó có thông tin về ADN. Thông tin về ADN (khẳng định hay loại trừ mối quan hệ) có vai trò đóng góp quan trọng trong quá trình phân tích, điều tra để có thể đi đến kết luận cuối cùng.
3.5. Thảo luận chung
Những tiến bộ trong phân tích, giám định ADN từ hài cốt người đã và đang cung cấp những thông tin quý giá về nguồn gốc, di cư, y tế, phân tích phả hệ tổ tiên địa sinh học, kiểu hình và xác định danh tính của những cá nhân đã chết trong thời gian dài phục vụ cho mục đích nghiên cứu ứng dụng pháp y, tiến hóa, y tế, khảo cổ.
Những kết quả này là do sự phát triển của các bước phân tích sau tách chiết như tăng cường độ nhạy của PCR [9], thiết kế và tối ưu hóa các mồi để giảm kích thước amplicon, sử dụng các chỉ thị ADN nhạy với mẫu đã bị phân mảnh (SNP, indel…), phát triển các kỹ thuật giải trình tự (next-sequencing)… tập trung vào việc tối ưu
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 51
thu hồi thông tin di truyền từ lượng ADN thấp và đã bị suy thoái mạnh từ xương.
Ngược lại, quá trình thu mẫu và các kỹ thuật tách chiết ADN từ xương và răng lâu năm vẫn không thay đổi hoặc chỉ thay đổi rất ít kể từ những nghiên cứu đầu tiên từ hơn hai thập kỷ trước đây [26],[27].
Đồng thời với những tiến bộ kỹ thuật những hiểu biết về bản chất và trạng thái của ADN tồn tại trong xương lâu năm càng được mở rộng và sáng tỏ, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng bước thu, tách chiết ADN từ mẫu xương là rất quan trọng và có ảnh hưởng lớn đến số lượng và tính toàn vẹn của ADN nội sinh, độ tinh sạch của khuôn ADN sau tách chiết và do đó có tính quiết định đến thành công của những phân tích về sau. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy việc lựa chọn đúng phương pháp tách chiết có thể cải thiện đáng kể kết quả phân tích ADN các mẫu xương lâu năm.
Kinh nghiệm của chúng tôi khi làm việc với số lượng lớn các mẫu xương mà phần lớn đều bị phân hủy mạnh dưới tác động của yếu tố môi trường cho thấy rằng rất khó để dự đoán lượng ADN sau tách chiết và thu hồi thành công một hồ sơ nADN hoàn chỉnh từ những đặc điểm hình thái ban đầu của xương. Đó cũng là lý do để không thể có được một qui trình tách chiết, phân tích phổ quát cho tất cả các đối tượng xương lâu năm, mỗi PTN, dựa trên điều kiện trang thiết bị, cơ sở vật chất và đặc biệt là đối tượng mẫu phân tích cần phải tự xây dựng cho mình qui trình tách chiết xương riêng.
Mẫu xương chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là những mẫu xương được đánh giá là những mẫu khó, thứ nhất là tuổi xương (các xương trên 40 năm tuổi), thứ hai là các mẫu xương tiếp xúc với các yếu tố môi trường rất tiêu cực (chôn trong đất trũng phèn, nhiệt độ và độ ẩm trung bình hàng năm cao…) làm cho ADN trong xương đều ở trạng thái phân hủy mạnh và lẫn nhiều tạp chất. Để xây dựng được một qui trình tách chiết, phân tích ADN xương phù hợp với các mẫu này chúng tôi lựa chọn hướng nghiên cứu tiếp cận bằng các kiến thức cơ bản về mô học, sinh học phân tử để có được một bức tranh tổng thể về trạng thái, tính chất của ADN trong xương lâu năm làm nền tảng từ đó tối ưu từng bước của qui trình. Các
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 52
bước thu, lựa chọn mẫu xương tại hiện trường, bảo quản mẫu sau khi thu, các bước xử lý ban đầu, khử khoáng, kỹ thuật tách chiết và kỹ thuật phân tích ADN sau tách chiết (tối ưu chu trình nhiệt, thêm chất tăng cường vào thành phần PCR…) đều được nghiên cứu tối ưu dựa trên cơ sở các kiến thức chuyên sâu về đối tượng (mẫu xương, ADN trong xương…). Kết quả xây dựng qui trình phân tích nADN xương là kết quả lớn, được chúng tôi kết hợp từ nhiều nghiên cứu tối ưu khác nhau, ví dụ như phần tối ưu thành phần PCR và các biện pháp tăng cường thu kết quả phân tích STR nhân từ các khuôn ADN nghèo và đã bị suy thoái mạnh thành các trình tự kích thước ngắn (mẫu LCN – Low copy number) là kết quả của quá trình nghiên cứu trên đối tượng mẫu dấu vết ADN [4].
Trong đề tài này, kết quả quan trọng nhất là chúng tôi đã so sánh các đặc điểm và lựa chọn được phương pháp tách chiết ADN phù hợp cả về mặt kỹ thuật lẫn kinh phí để thiết lập được qui trình tách chiết, phân tích ADN cho xương lâu năm có thể áp dụng thường qui tại PTN đối với các mẫu xương khó. Chúng tôi đã gửi đánh giá qui trình tại 01 PTN trong nước và cho kết quả tốt. Những dữ liệu của chúng tôi trong đề tài này chưa thể đánh giá thấu đáo các phương pháp tách chiết ADN trong mẫu xương lâu năm hiện nay, và đó cũng là điểm còn chưa hoàn thiện cần phải nghiên cứu sâu hơn.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Qua các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã lựa chọn và tối ưu qui trình tách chiết ADN từ mẫu xương lâu năm phù hợp với điều kiện tồn tại mẫu (hài cốt trên 40 năm tuổi chôn trong đất tại vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm điển hình) và năng lực phân tích hiện tại của PTN ở Việt Nam.
Qui trình như sau: Xử lý mẫu ban đầu bằng cách sử dụng giấy ráp loại bỏ chất bẩn bên ngoài, siêu âm trong dung dịch tẩy rửa 5%, cuối cùng chiếu tia UV khử trùng bề mặt xương trong 10 phút. Tiếp theo cân 2g bột xương, ủ với 30ml EDTA trong 24 h ở 37oC. Tiến hành tách mẫu theo qui trình của Kit IQS có cải tiến: Mẫu sau khi được loại canxi, bổ sung 4ml đệm ủ. Lắc 200v/p để trộn mẫu với dịch ủ và ủ qua đêm ở 560C. Sử dụng cột Amicon cụ mẫu đến khi thể tớch dịch cũn khoảng 200 àl . Tiếp tục tỏch chiết theo các bước của nhà sản xuất
2. Đã xây dựng qui trình phân tích ADN nhân từ xương lâu năm bổ sung vào hồ sơ cá nhân giúp nhận dạng cá thể
3. Đã ứng dụng qui trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm với 50 mẫu hài cốt trên 40 năm chôn trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của Việt Nam. Tỉ lệ phân tích thành công ADN nhân là 66%.
Kiến nghị
1. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật định lượng PCR (qPCR) để đánh giá tình trạng mẫu khuôn ADN sau tách chiết và định hướng bước phân tích tiếp theo trong giám định ADN xương lâu năm phục vụ mục đích truy nguyên cá thể.
2. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tách chiết sử dụng hệ thống robot tách chiết tự động trên các mẫu xương lâu năm.