CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lựa chọn mẫu
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng răng hàm, các xương chịu lực hay còn gọi xương dài (xương đùi, xương chày, xương trụ, xương mác…) thường là mẫu ưu tiên trong quá trình thu mẫu giám định ADN. Tuy nhiên các mẫu răng hàm sẽ bền vững hơn về mặt cấu trúc so với các mẫu xương dài nên thường được lựa chọn nhiều cho phân tích. Với mục tiêu thu mẫu để phân tích ADN hệ gen nhân trong xương lâu năm, chúng tôi xác định các mẫu thu thập ngoài điều kiện về thời gian tồn tại sau khi chết (từ 20 – 50 năm), các mẫu thu thập phải là những mẫu có chất lượng tốt hoặc có mức độ phân hủy nhẹ.
Các tiêu chí lựa chọn mẫu được chúng tôi đặt ra dựa trên đánh giá sơ bộ về tiêu chuẩn hình thái như sau:
(1) Ưu tiên lựa chọn các mẫu răng hàm, xương dài.
(2) Lựa chọn mẫu có độ cứng chắc cao, giữ nguyên được hình thái ban đầu hoặc có mức độ phân hủy nhẹ (mẫu tồn tại ở dạng mảnh xương, không bị vỡ vụn, không bị mủn).
Các tiêu chí lựa chọn được đưa ra với định hướng nhằm đảm bảo khả năng thành công tối đa cho phân tích các locus STR trên ADN nhân.
Căn cứ các tiêu chí đặt ra, chúng tôi đã phối hợp với Cục người có công - Bộ LĐTB & XH tiến hành thu thập các mẫu xương lâu năm sử dụng cho nghiên cứu đề tài. Các mẫu được thu tại Nghĩa trang liệt sĩ Mộc Hóa - Tỉnh Long An, thuộc thị xã Kiến Xương, Tỉnh Long An. Điều kiện tự nhiên của vùng nằm trong khu vực Đồng Tháp Mười, đất chủ yếu là đất trũng phèn, ngập nước hàng năm. Khí hậu nhiệt đới gió mùa, chia làm 2 mùa mưa nắng rõ rệt. Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 27,4 - 27,90C. Số giờ nắng trung bình hàng năm từ 2.454 - 2.669 giờ. Lượng mưa trung bình hàng năm 1.347 - 2.464 mm. Độ ẩm tương đối trung bình hàng năm 79,4 - 80,9%.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 28
2.2.2. Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu và bố trí khu vực thí nghiệm sau khi thu mẫu
Các cán bộ thu mẫu phải mặc áo bảo hộ, đi găng tay và sử dụng khẩu trang để ngăn ngừa nhiễm mẫu. Các mẫu sau khi thu tại hiện trường được bảo quản trong các túi thu mẫu chuyên dụng, mỗi mẫu được đánh mã số riêng.
Trong quá trình khai quật và giám định ban đầu, chúng tôi phải tiến hành đánh giá rất cẩn thận để bảo đảm mẫu xương thu được đủ tốt cho các bước phân tích về sau, đồng thời, các mẫu sau khi chuyển về phòng thí nghiệm đều được bảo quản ở tủ lạnh âm sâu (-20oC) để đảm bảo ADN trong mẫu được giữ lại ở điều kiện tốt nhất.
Khu vực sử dụng cho các xét nghiệm phân tích ADN đối với mẫu hài cốt được chúng tôi phân thành 05 khu riêng biệt cho các bước xử lý, tách mẫu, chuẩn bị PCR, chạy PCR, điện di sản phẩm nhân bội và phân tích kết quả.
Những người thực hiện phải có đầy đủ kiến thức để tránh việc nhiễm ADN ngoại lai vào mẫu do lỗi thao tác kĩ thuật chưa thành thạo có thể xảy ra ở bất cứ bước nào trong khi làm thí nghiệm, ví dụ như đưa tay ngang qua tube đang mở hoặc chạm vào bên trong nắp ống khi mở hoặc đóng ống… Để đảm bảo giảm tối đa khả năng nhiễm, những người thực hiện cần được trang bị kiến thức và thực hành thành thạo các thao tác về các vấn đề liên quan và các hướng dẫn phòng ngừa. Mỗi cá nhân có liên quan đến khu vực PTN phân tích ADN đều phải được lập hồ sơ ADN cá nhân.
Việc tách các mẫu ADN hiện đại từ các sinh phẩm khác như máu, tóc, niêm mạc miệng cần cách ly với khu vực xử lý và tách mẫu hài cốt để tránh tuyệt đối việc lây nhiễm mẫu ADN vào các mẫu hài cốt.
Các vật dụng cần trang bị và sử dụng ở tất cả các bước để ngăn ngừa nhiễm:
khẩu trang phẫu thuật, găng tay, mũ trùm tóc, tay áo dùng một lần, quần áo phòng thí nghiệm chuyên dụng, giày (hoặc bao giày). Bộ quần áo bảo hộ cá nhân không được mang ra khỏi khu vực làm việc.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 29
Tất cả các khay đựng, pipet… phải được lau rửa sạch bằng thuốc tẩy và chiếu tia UV (ngừa crosslinker trong tối đa 30p ở bước sóng 254nm) sau mỗi thao tác.
2.2.3. Xử lý mẫu – Loại canxi.
Xử lý mẫu
Một trong những bước quan trọng của quy trình phân tích đối với mẫu xương lâu năm là khâu xử lý mẫu ban đầu. Việc xử lý mẫu ban đầu cũng như việc thực hiện các bước tách chiết sau này được thực hiện theo nguyên tắc chung đối với tất cả các phòng thí nghiệm: (1) đảm bảo làm sạch mẫu nhưng không ảnh hưởng lớn tới sự nguyên vẹn và hàm lượng ADN có trong mẫu; (2) đảm bảo tuyệt đối không nhiễm ADN ngoại lai và không nhiễm chéo giữa các mẫu.
Tiến hành cọ rửa mẫu dưới vòi nước (để loại bỏ chất bẩn bên ngoài) sử dụng giấy ráp hoặc bàn chải dùng một lần để loại bỏ bụi, mô mềm và những chất bẩn bên ngoài. Loại bỏ 1-3 mm (tùy thuộc vào từng loại mẫu) lớp bề mặt ngoài của xương.
Sau đó cắt xương thành mảnh nhỏ, đặc biệt cần thiết đối với các mẫu xương đã bị rạn và cong. Siêu âm mẫu trong nước gia ven (NaClO) 5% trong 1 - 2 phút. Lặp lại bước rửa siêu âm 2-3 lần. Súc rửa mẫu với nước khử ion (ddH2O) trong 5 phút. Mẫu được ngâm chìm và lắc mạnh trong 30 giây. Siêu âm trong ddH2O trong 1-2 phút. Sau đó rửa một lần với ethanol 100%. Để mẫu trong ống falcon mở nắp, để khô qua đêm trong tủ hốt ở nhiệt độ phòng. Chuyển mẫu sang ống falcon mới có ghi mã số mẫu tương ứng. Chiếu tia UV khử trùng bề mặt xương trong 10 phút. Chuyển mẫu sang cối nghiền. Chạy máy nghiền không quá 2 phút, sau đó kiểm tra độ mịn của mẫu.
Chuyển bột mẫu đã nghiền mịn đĩa cân, lấy khoảng 1 gam sang ống 50 ml mới có đánh dấu kí hiệu mẫu. Rửa sạch toàn bộ các bề mặt, cối nghiền, cốc, tủ, dụng cụ khác bằng chất tẩy rửa sau khi xử lý xong mẫu.
Loại canxi
Các ma trận khoáng và các mối liên kết hóa học giữa các phân tử có tác dụng bảo vệ tốt ADN trong xương trước các yếu tố bất lợi từ môi trường nhưng đồng thời nó cũng cản trở quá trình tiếp xúc của các hóa chất trong quá trình tách
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 30
chiết ADN và PCR. Đối với mẫu xương lâu năm các phân tử ADN kẹt trong ma trận khoáng của xương. Loại bỏ phần vô cơ được tiến hành bằng cách ủ bột xương trong dung dịch EDTA nhằm tách các ion Ca2+ khỏi các hợp chất, giải phóng ADN các mối liên kết trong ma trận khoáng. Đây cũng chính là cơ sở cho bước khử khoáng trong quy trình tách chiết ADN từ xương lâu năm, không phân biệt phương pháp tách chiết ADN sử dụng phía sau.
Cân khoảng 0,5 gam bột xương cho vào ống falcon 50 ml. Thêm 30ml EDTA 0,5M, pH8 đã khử trùng. Đặt mẫu theo chiều ngang lên máy lắc, ủ ở 37oC trong 24 h. Ly tâm 5000v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi. Lặp lại bước bổ sung EDTA thêm 2 lần, tuy nhiên thời gian ủ – lắc để ngắn hơn, từ 3- 5 h. Thêm 20 ml ddH2O, vortex cho tới khi đồng nhất dung dịch. Ly tâm 5000v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi. Lặp lại bước bổ sung nước thêm 2 lần. Cặn ly tâm có thể sử dụng cho tách chiết ADN.
2.2.4. Tách chiết ADN từ xương bằng phương pháp hữu cơ (Phenol/
Chloroform/ Isoamyl alcohol: PCI)
Nguyên tắc chính của phương pháp này là do các phân tử phenol có tính kị nước nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị nước của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, do đó làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị nước (gốc amino acid) ra ngoài. Trong khi đó ADN vẫn là chất tan trong nước và có thể hút sang ống chứa khác. Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều cũng có thể làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều có thể làm đứt gẫy ADN). Trong khi đó sử dụng chloroform/
isoamyl alcohol thì phải đảo trộn kĩ vì các chất này không tan trong nước. Tuy nhiên khi thêm chloroform/ isoamyl alcohol vào phenol sẽ làm tính kị nước của phenol tăng lên và làm tăng tính hiệu quả biến tính protein. Isoamyl alcohol có tác dụng loại bỏ bọt và ngăn cản sự tạo bọt trong dung dịch, làm ổn định 2 pha nước và phenol hoặc chloroform sau ly tâm. Khi mẫu ly tâm, trong ống eppendorf sẽ phân tách thành 3 lớp. Lớp thứ nhất là ADN, lớp giữa là những cặn bã và protein, lớp cuối cùng là phenol hoặc chloroform. Phương pháp tách chiết PCI sử dụng theo công bố của tác giả Alonso và cộng sự năm 2001 [5].
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 31
Qui trình tách chiết:
Mẫu sau khi được loại canxi, bổ sung 2 ml đệm ủ (1,88 ml Bone incubation buffer; 120 l Proteinase K) vào cặn bột xương. Lắc 200v/p để trộn mẫu với dịch ủ và ủ qua đêm ở 560C. Ly tâm 5.000v/p trong 5 phút. Thu dịch phân giải vào ống eppendorf 1,5 ml sạch đã khử trùng. Bổ sung 1V dung dịch PCI 25:24:1 vào dịch thu được. Vortex, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 5.000 v/p, 5 phút. Thu dịch pha trên và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Lặp lại bước chiết mẫu bằng PCI 25:24:1 thêm 02 lần. Bổ sung 1V dung dịch n-buthanol vào dịch thu được sau khi chiết 3 lần bằng PCI 25:24:1. Vortex mạnh và để ở nhiệt độ thường trong 5 phút. Dùng pipet thao tác cẩn thận để loại bỏ dần pha trên rồi thu dịch pha dưới vào ống eppendorf 1,5ml mới. Hút chuyển dịch thu được vào ống cô mẫu Amicon. Ly tâm ống Amicon sao cho dịch thu được còn khoảng 50 l (thời gian và tốc độ ly tâm ống tuỳ chỉnh để thu được thể tích cuối cùng là 50 l). Hút thu dịch cô đặc trong ống Amicon chuyển sang ống sạch vô trùng. Định lượng mẫu sau tách chiết.
Bảo quản dịch thu được ở -200C.
2.2.5. Tách chiết ADN từ xương bằng KIT QIAmp DNA Investigator (QiAgen) - INV
Chuẩn bị hóa chất
Đệm ủ ATL, AL sử dụng trực tiếp. Đệm rửa AW1: Bổ sung 25 ml Ethanol (96-100%) vào lọ có chứa 19 ml đệm AW1 cô đặc. Đánh dấu vào tem nhãn để xác định Ethanol đó được bổ sung. Đệm rửa AW2: Bổ sung 30 ml Ethanol (96-100%) vào lọ chứa 13 ml đệm AW2 cô đặc. Chú ý lắc ống đệm AW2 trước khi sử dụng.
ôang 1,5ml vô trùng (Chú ý: Tính lượng hoá chất dùng riêng cho từng đợt, hút chuyển vào lọ. Lượng còn dư để riêng, bảo quản theo hướng dẫn và sử dụng cho những lần tách chiết sau)
Chuẩn bị các mẫu gồm
Mẫu bột xương sau loại Canxi. Mẫu đối chứng (-) trong quá trình loại Canxi.
Mẫu đối chứng (-) cho quá trình tách chiết để kiểm tra nhiễm. Mẫu Đối chứng (+) cho quá trình tách chiết để kiểm tra chất lượng hoá chất.
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 32
Qui trình tách chiết
Thực hiện đúng theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Dịch thu được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Định lượng mẫu sau tách chiết. KIT DNA IQ System (Promega)- IQS
2.2.6. Tách chiết ADN từ xương bằng KIT DNA IQTM System (Promega) - IQS.
Chuẩn bị hoá chất
Proteinase K – 18 mg/ml. Digestion solution (Dung dịch phân giải). Dung dịch được chuẩn bị mới ngay trước mỗi lần ủ theo công thức:
1 ml Digestion solution = 940 l Bone Incubation Buffer + 60 l Proteinase K 18 mg/ml. Thể tích dung dịch phân giải được chuẩn bị tương ứng với số mẫu và pha trong ống Falcon hoặc Eppendorf để khử trùng và xử lý loại nhiễm.
Thành phần Lysis buffer (Đệm phân giải)/ DTT: 100 l Lysis buffer + 1 l DTT 1M
Wash buffer (Đệm rửa)1X: Pha với Ethanol 100% và Iso propanol 100% theo tỷ lệ:
2V Wash buffer 2X (stock) + 1V Ethanol + 1V Iso propanol (Thể tích cần chuẩn bị được tính toán cho bước rửa, mỗi mẫu cần sử dụng 300ul Wash buffer 1X. Wash buffer 1X được pha trong ống Epp 1.5ml vô trùng).
Chuẩn bị các mẫu gồm:
Mẫu bột xương sau loại Canxi. Các mẫu đối chứng Các bước tách chiết:
Mẫu sau khi được loại canxi, bổ sung đệm ủ) vào cặn bột xương. Lắc 200v/p để trộn mẫu với dịch ủ và ủ qua đêm ở 560C. Sau khi ủ, ly tâm ống chứa dịch 5000v/p trong 10 phút. Thu dịch. Bổ sung 2 V Lysis buffer/DTT vào dịch thu được +30 àl Resin(hạt từ). Ủ ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt. Đặt ống lờn giỏ từ chờ cho cỏc hạt Resin bị hỳt về 1 phớa trờn thành ống. Hỳt bỏ dịch. Bổ sung 100 àl Lysis buffer/DTT (lần 2) vào ống. Sau khi ủ, lắc mạnh ống trong 5 giây và đặt ngay lên giỏ từ, hỳt bỏ dịch. Lấy ống ra khỏi giỏ từ, bổ sung 100 àl Lysis buffer/DTT (lần 2) vào ống. Đặt ống trở lại giỏ từ. Hỳt bỏ dịch. Bổ sung 100 àl Wash buffer 1X vào ống. Đặt ống trở lại giá từ, chờ cho các hạt Resin bị hút về 1 phía trên thành ống.
Hút loại bỏ dịch. Lặp lại bước rửa tất cả là 3 lần. Trên giá từ, mở nắp để làm khô
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 33
khối hạt từ trong 5 – 10 phỳt. Nhấc ống ra khỏi giỏ từ, bổ sung 50 àl Elution buffer vô trùng vào khối hạt từ trong ống. Vortex ống để hoà khối hạt từ vào dịch. Đặt ống vào thiết bị gia nhiệt 60oC trong vòng 5 phút. Lấy ống ra khỏi thiết bị gia nhiệt, vortex mạnh trong 5 giây và đặt ngay ống lên giá từ. Hút dịch có chứa ADN sang ống sạch vô trùng. Kiểm tra độ tinh sạch mẫu tách chiết bằng Nanodrop. Bảo quản mẫu sau tách chiết ở nhiệt độ -20oC.
2.2.7. Định lượng ADN
Sau khi thu nhận sản phẩm ADN sau tách chiết, chúng tôi tiến hành phân tích định lượng khuôn bằng phương pháp đo mật độ quang phổ để xác định mức độ tinh sạch và nồng độ ADN có trong khuôn.
Nồng độ và độ sạch của ADN được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ ADN được tính theo công thức:
[ADN] = A260 x n x 50 (àg/ml)
Trong đó A260 : độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm n : số lần pha loãng mẫu
50 : nồng độ ADN ứng với độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm là 1 A280 là độ hấp thụ của protein ở bước sóng 280 nm. ADN được xem là tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy đo quang phổ kế và phần mềm NanoDrop để kiểm tra độ tinh sạch của các khuôn ADN sau tách chiết. Các bước tiến hành đo OD sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.8. PCR nhân bội sản phẩm
Kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, đoạn DNA quan tâm được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lượng phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 34
- Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao (94°C – 96°C ).
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đầu của đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên khoảng 70 80°C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy GeneAmp PCR 9700 của hóng Applied Biosystems với tổng thể tớch phản ứng là 25 àl gồm cỏc thành phần được liệt kê dưới đây:
3.
Thành phần Thể tích (l) PowerPlex®HS 5X Master Mix 5 PowerPlex®16 HS 10X Primer Mix 2,5
ADN khuôn 5
Nước khử ion 12,5
Tổng thể tích 25
Với chu trình nhiệt là 96°C - 2 phút, 32 chu kỳ (94°C, 1 phút ; 60°C, 1 phút ; 72°C, 90 giây), 60°C, 45 phút, sau đó giữ ở 4°C.
2.2.9. Điện di và đọc kết quả trên máy điện di mao quản
Chuẩn bị mẫu
Trộn mẫu sản phẩm PCR theo tỷ lệ:1 l sản phẩm PCR + 0,5 l ILS 600 + 10 l HiDi Formamide; trộn thang alen (Allelic Ladder) theo tỷ lệ: 1,5 l thang alen (Allelic Ladder) + 0,5 l ILS 600 + 10 l HiDi Formamide; biến tính mẫu và thang alen đã trộn ở 95oC trong thời gian 3 phút rồi cho ngay lên khay đá lạnh đã được chuẩn bị.
Điện di trên máy 3130 Genetic Analyzer và đọc kết quả
Cho mẫu sản phẩm PCR và thang alen (đã chuẩn bị ở bước 1) lên hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer, khai báo các thông tin cần thiết để tạo sample sheet
Khóa học 2014-2016
Trần Thị Hạnh 35
mới trong phần mềm chạy máy 3130 Data Collection software v3.0. Đọc kết quả kiểu gen ADN của mẫu. Lưu hồ sơ.
Dưới đây là sơ đồ các bước nghiên cứu thể hiện ở hình 2.1.
Hình 2.1: Sơ đồ các bước nghiên cứu của đề tài luận văn THU MẪU
PHÂN LOẠI THEO TIÊU CHUẨN (50 mẫu)
LỰA CHỌN 10 MẪU THỬ NGHIỆM 3 PHƯƠNG PHÁP
BẢO QUẢN 40 MẪU ĐÃ THU Ở -20OC
ĐÁNH GIÁ, LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP TỐT NHẤT
XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ADN NHÂN TỪ XƯƠNG LÂU
NĂM
ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH TẠI 01 CƠ SỞ PTN TRONG NƯỚC
PHÂN TÍCH MẪU
ÁP DỤNG QUI TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG VỚI CÁC MẪU HÀI CỐT ĐÃ THU