Chương 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
3.5.2 Phân tách phần chiết lá điclometan (AJLD)
Phần chiết lá điclometan (AJLD) (40 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm). Cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong n-hexan và mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel.
Cột sắc ký đƣợc rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 49:1, 29:1, 19:1, 12:1, 9:1, 6:1, và 3:1 (v:v) cho 70 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml.
Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 12 nhóm phân đoạn: AJLD1 (các phân đoạn 2-6), AJLD2 (7-14), AJLD3 (15-22), AJLD4 (23-28), AJLD5 (29-35), AJLD6 (36-46), AJLD7 (47-49), AJLD8 (51-52), AJLD9 (53-54), AJLD10 (57-59), AJLD11 (60-66), và AJLD12 (67-70).
Hai nhóm phân đoạn AJLD5 và AJLD6 có sắc ký đồ TLC tương tự nhau đƣợc gộp lại thành nhóm phân đoạn AJLD56 (2,29 g). Nhóm phân đoạn này đƣợc tinh chế bằng CC trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm), rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 29:1, 19:1, 9:1, 6:1 và 3:1. Phân tích TLC cho phép gộp 27 phân đoạn phân tách, mỗi phân đoạn 20 ml, thành 2 nhóm phân đoạn AJLD56.1 (0,82 g) và AJLD56.2 (0,44 g) . Nhóm phân đoạn AJLD56.1 đƣợc rửa bằng n-hexan cho eudesman (AJLD56.1) (8,5 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Nhóm phân đoạn AJLD56.2 đƣợc rửa bằng MeOH cho chất ceramid A (AJLD56.2) (2,7 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Nhóm phân đoạn AJLD8 (0,57g) đƣợc rửa bằng n-hexan cho artemisidiol A (AJLD8) (9 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Nhóm phân đoạn AJLD9 (0,68) đƣợc rửa bằng n-hexan cho eupatorin (AJLD9) (2,8 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng.
Nhóm phân đoạn AJLD10 (2,42g) đƣợc phân tách bằng cột CC trên pha đảo Merck RP-18 (cỡ hạt 5 àm) với cỏc hệ dung mụi MeOH-H2O 70%, 80%, 90%, và MeOH. Sau khi được cất loại dung môi dưới áp suất giảm và kiểm tra TLC các
(1,64 g) bằng CC trờn silica gel (Merck, 40-63 àm) với hệ dung mụi gradient n- hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, và 1:1 cho 4,5-dihydroxy-3,5,6,7- tetrametoxyflavon (AJLD10) (1,8 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng.
3.5.3 Phân tách các phần chiết cành n-hexan và điclometan (AJCHD)
Các phần chiết cành n-hexan (AJLCH) và diclometan (AJLCD) đƣợc phân tích TLC cho thấy chúng có các thành phần tương tự nhau. Phân đoạn gộp của 2 phần chiết này (AJCHD) (25 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 àm). Cột được nhồi theo phương phỏp nhồi ướt trong n- hexan và mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel.
Cột sắc ký đƣợc rửa giải với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan- axeton với các tỷ lệ 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 3:1 và 1:1 (v:v) cho 40 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml. Các phân đoạn có sắc ký đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại và được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 7 nhóm phân đoạn AJCHD1 (các phân đoạn 1-5), AJCHD2 (6-8), AJCHD3 (9-15), AJCHD4 (16-24), AJCHD5 (25-34), AJCHD6 (35-37), và AJCHD7 (38-40).
Nhóm phân đoạn AJCHD2 (0,56 g) đƣợc tinh chế bằng Mini-C trên silica gel (Merck , cỡ hạt 40-63 àm), rửa giải với hệ dung mụi gradient n-hexan-axeton 90:1, 60:1, 49:1, 29:1, 19:1, và 9:1. Dựa trên các sắc ký đồ TLC 28 phân đoạn phân tách, mỗi phân đoạn 20 ml đƣợc gộp lại thành 4 nhóm phân đoạn AJCHD2.1 đến AJCHD2.4. Nhóm phân đoạn AJCHD2.2 (0,18g) đƣợc rửa bằng MeOH cho 1- pentatriacontanol (AJCHD2.2) (2,3 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Nhóm phân đoạn AJCHD3 (1,95 g) đƣợc rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (AJCHD3) (64 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Nhóm phân đoạn AJCHD5 (3,43 g) được phân tách bằng sắc kí cột thường (CC) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm), rửa giải với hệ dung mụi gradient n- hexan-EtOAc 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1. Cho 60 phân đoạn phân tách, mỗi
dựa trên sắc ký đồ TLC. Nhóm phân đoạn AJCHD5.2 (0,58 g) đƣợc phân tách CC trờn pha đảo Merck RP-18 (cỡ hạt 5 àm) với hệ dung mụi gradient MeOH-H2O 70%, 80%, 90%, và MeOH. Phân đoạn MeOH-H2O 70% (0,37g) đƣợc tinh chế bằng Mini-C trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 15-40 àm), rửa giải với hệ dung mụi gradient n-hexan-EtOAc 29:1, 19:1, 9:1, và 3:1 cho hỗn hợp 2 chất (24R)-cycloart- 25-en-3β,24-diol và (24S)-cycloart-25-en-3β,24-diol (AJCHD5.2) (3,3 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Nhóm phân đoạn AJCHD6 (1,48 g) được phân tách bằng sắc kí cột thường (CC) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm), rửa giải với hệ dung mụi gradient n- hexan-EtOAC 29:1, 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1. Các phân đoạn phân tách, mỗi phân đoạn 20 ml đƣợc gộp thành 3 nhóm phân đoạn từ AJCHD6.1 đến AJCHD6.3 dựa trên sắc ký đồ TLC. Nhóm phân đoạn AJCHD6.3 (0,55g) đƣợc rửa bằng MeOH cho chất ceramid B (AJCHD6) (24 mg) dưới dạng bột vô định màu trắng.
3.6 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP
3.6.1 Chất AJLH4 (1-Pentatriacontanol)
Đƣợc phân lập từ các phân đoạn AJLH3, AJLH4 và AJCHD2.2.
Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,5 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 35-CH3), 1,26 (64H, s br, 4- CH2→34-CH2), 1,57 (2H, quintet, J = 7,0 Hz, 3-CH2), 3,64 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-1).
3.6.2 Chất AJLH5.1 (Axit tricosanoic) Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJLH5.1.
Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 23-CH3), 1,25 (38H, s br, 4- CH2→ 22-CH2), 1,63 (2H, quintet, J = 7,5 Hz, 3-CH2), 2,34 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2-
3.6.3 Chất AJLH6 (β-Sitosterol)
Đƣợc phân lập từ các phân đoạn AJLH5.3, AJLH6, và AJCHD3.
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136 oC. Rf = 0,45 (TLC, silica gel, n- hexan-axteton 9:1, v:v).
3.6.4 Hỗn hợp hai chất AJLH8.2.1a (24(R)-Cycloart-25-en-3β,24-diol) và AJLH8.2.1b (24(S)-Cycloart-25-en-3 β,24-diol)
Đƣợc phân lập từ các phân đoạn AJLH8.2.1 và AJCHD5.2.
Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,35 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3) (AJLH8.2.1a): δ (ppm) 0,33 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19a), 0,55 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19b), 0,81 (3H, s, 28-CH3), 0,88 (3H, d, J = 6,0 Hz, 21-CH3), 0,89 (3H, s, 30-CH3), 0,97 (6H, s, 18-CH3, 29-CH3), 1,73 (3H, s, 27-CH3), 3,28 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,0 Hz, H-3), 4,02 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-24), 4,83 (1H, s, H- 26a), 4,92 (1H, s, H-26b).
13C-NMR/DEPT (CDCl3) (AJLH8.2.1a): δ (ppm) 14,0 (q, C-29), 17,6 (q, C-27), 18,0 (q, C-18), 18,3 (q, C-21), 19,3 (q, C-28), 20,0 (s, C-9), 21,1 (t, C-6), 25,4 (q, C-30), 26,0 (s, C-10), 26,1 (t, C-7), 26,5 (t, C-11), 28,0 (s, C-16), 29,9 (t, C-19), 30,4 (t, C-2), 31,5 (t, C-23), 31,92(t, C-1), 31,98 (t, C-22), 32,9 (t, C-12), 35,6 (t, C- 15), 35,93 (d, C-20), 40,5 (s, C-4), 45,3 (s, C-13), 47,1 (d, C-5), 47,9 (d, C-8), 48,8 (s, C-14), 52,2 (d, C-17), 76,4 (d, C-24), 78,9 (d, C-3), 111,4 (t, C-26), 147,8 (s, C- 25).
1H-NMR (CDCl3) (AJLH8.2.1b): δ (ppm) 0,33 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19a), 0,55 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19b), 0,81 (3H, s, 28-CH3), 0,88 (3H, d, J = 6,0 Hz, 21-CH3), 0,89 (3H, s, 30-CH3), 0,97 (6H, s, 18-CH3, 29-CH3), 1,73 (3H, s, 27-CH3), 3,28 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,0 Hz, H-3), 4,02 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-24), 4,83 (1H, s, H- 26a), 4,93 (1H, s, H-26b).
13C-NMR/DEPT (CDCl ) (AJLH8.2.1b): δ (ppm) 14,0 (q, C-29), 17,2 (q, C-27),
C-30), 26,0 (s, C-10), 26,1 (t, C-7), 26,5 (t, C-11), 28,1 (t, C-16), 29,9 (t, C-19), 30,4 (t, C-2), 31,7 (t, C-23), 31,92 (t, C-1), 31,98 (t, C-22), 32,9 (t, C-12), 35,6 (t, C-15), 35,96 (d, C-20), 40,5 (s, C-4), 45,3 (s, C-13), 47,1 (d, C-5), 47,9 (d, C-8), 48,8 (s, C-14), 52,2 (d, C-17), 76,7 (d, C-24), 78,9 (d, C-3), 110,9 (t, C-26), 147,5 (s, C-25).
3.6.5 Chất AJLH8.2.2 (23(Z)-Cycloart-23-en-3β,25-diol) Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJLH8.2.2.
Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,30 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,32 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-19a), 0,55 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-19b), 0,81 (3H, s, 28-CH3), 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 0,88 (3H, s, 30-CH3), 0,96 (6H, s, 18-CH3, 29-CH3), 1,31 (6H, s, 26-CH3, 27-CH3), 3,38 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,0 Hz, H-3), 5,59 (2H, s br, H-23, H-24).
13C-NMR/DEPT (CDCl3): δ (ppm) 14,0 (q, C-29), 18,1 (q, C-18), 18,3 (q, C-21), 19,3 (q, C-28), 20,0 (s, C-9), 21,1 (t, C-6), 25,4 (q, C-30), 26,0 (s, C-10), 26,2 (t, C- 7), 26,5 (t, C-11), 28,1 (t, C-16), 29,9 (t, C-19), 29,99 (2 q, C-26, C-27), 30,4 (t, C- 2), 31,9 (t, C-1), 32,8 (t, C-12), 35,6 (t, C-15), 36,4 (d, C-20), 39,1 (t, C-22), 40,5 (s, C-4), 45,3 (s, C-13), 47,1 (d, C-5), 47,9 (d, C-8), 48,8 (s, C-14), 52,0 (d, C-17), 70,8 (s, C-25), 78,9 (d, C-3), 125,6 (d, C-23), 139,4 (d, C-24).
3.6. 6 Chất AJLD56.2 (Ceramid A) Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJLD56.
Bột vô định hình màu trắng Rf = 0,43 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3 + CD3OD): δ 0,88 (6H, t, J = 6,5 Hz), 1,26 (n CH2, s br), 1,58 (2H, m), 1,68 (1H, m), 1,80 (1H, m), 2,00 (2H, m), 3,53 (2H, s br, H-2', H-4), 3,78 (1H, dd, J = 11,5Hz, 4,5 Hz, H-1a), 3,80 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,5 Hz, H-1b), 4,05 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 3,5 Hz, H-3), 5,40 (1H, s br, H-2).
Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJLD8.
Bột vô định hình màu trắng Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v:v).
[]23D +111,3(c 0,12, CH3OH).
IR max (film) cm–1:3329, 1733, 1712, 1627, 1438, 1378, 1247, 1159, 1038.
HR-ESI-MS (chế độ dương): m/z: 361,1623 [M + Na]+ (tính được cho C18H26O6Na:
316,1622).
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,93 (3H, s, 15-CH3), 1,91 (3H, s, 14-CH3), 1,95 (3H, s, 2'-CH3), 5,74 (1H, s, H-12a), 6,34 (1H, s, H-12b), 3,79 (3H, s) (13-OCH3), 3,38 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-1), 2,01, và 2,49 (2H, d br, J = 19,5 Hz, H- 2), 2,27 (1H, d br, J = 10,5 Hz H-5), 5,3 (1H, s br, H-3), 2,51 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 9,5 Hz, H-7), 4,06 (1H, dd, J = 10,5 Hz, 9,5 Hz, H-6), 5,41 (1H, ddd, J =12,0 Hz, 11,0 Hz, 5,0 Hz, H-8), 1,88 (1H, t, J = 12,0 Hz, H-9), 1,65 (1H, m, H-9).
13C-NMR/DEPT (CDCl3): δ (ppm) 17,1 (s), 21,1 (s), 24,6 (s), 32,1 (s), 38,6 (d), 39,1 (d), 41,5 (q), 53,1 (s), 57,4 (s), 70,2 (q), 71,5 (q), 73,2 (s), 128,8 (s), 134,5 (s), 138,3 (s), 167,3 (s), 170,4 (s).
3.6.8 Chất AJLD9 (Eupatorin) Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJLD9.
Bột vô định hình màu vàng. Rf = 0,55 (TLC, silica gel, CH2Cl2-MeOH 19:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3 + CD3OD): δ (ppm) 3,92 (3H, s), 3,99 (3H, s), 4,0 (3H, s) (6- OCH3, 7-OCH3, 4'-OCH3), 6,59 (1H, s, H-8), 6,60 (1H, s, H-3), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 7,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,49 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6').
13C-NMR/DEPT (CDCl3 + CD3OD): δ (ppm) 56,2 (q), 56,4 (q), 60,9 (q) (6-OCH3, 7-OCH3, 4'-OCH3), 90,9 (d, C-8), 103,9 (d, C-3), 106,1 (s, C-10), 109,0 (d, C-5'), 115,6 (d, C-2'), 120,8 (d, C-6'), 122,8 (s, C-1'), 132,6 (s, C-6), 147,7 (s, C-3'), 150,1 (s, C-4'), 152,7 (s, C-9), 158,9 (s, C-7), 164,7 (s, C-7), 182,9 (s, C-4).
Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJLD10.2.
Bột vô định hình màu vàng. Rf = 0,52 (TLC, silica gel, CH2Cl2-MeOH 19:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3 + CD3OD): δ (ppm) 3,92 (3H, s), 3,99 (6H, s), 4,0 (3H, s) (6- OCH3, 7-OCH3, 3'-OCH3, 5'-OCH3), 6,61 (2H, s, H-6, H-8), 7,15 (2H, s, H-2', H-6').
13C-NMR/DEPT (CDCl3 + CD3OD): δ (ppm) 56,5(q), 56,7 (2 q), 60,0 (q), (6- OCH3, 7-OCH3, 3'-OCH3, 5'-OCH3), 91,1 (d, C-8), 104,0 (d, C-2', C-6'), 104,3 (d, C- 3), 106,1 (s, C-10), 121,9 (s, C-1'), 132,7 (s, C-6), 139,5 (s, C-4'), 148,0 (2 s, C-3', C-5'), 153,5 (s, C-5), 159,1 (s, C-7), 164,8 (s, C-2), 182,9 (s, C-4).
3.6.10 Chất AJCHD6 ( Ceramid B) Đƣợc phân lập từ phân đoạn AJCHD6.
Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,35 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v:v).
1H-NMR (CDCl3 + CD3OD): δ (ppm) 0,88 (6H, t, J = 6,5 Hz), 1,26 (n CH2, s br), 1,58 (2H, m), 1,67 (1H, m), 1,80 (1H, m), 2,00 (2H, m), 3,55 (2H, s br, H-2', H-4), 3,74 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,5 Hz, H-1a), 3,81 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,5 Hz, H-1b), 4,04 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 3,5 Hz H-3), 4,09 (1H, s br, H-2).
13C-NMR/DEPT (CDCl3 + CD3OD): δ (ppm) 14,1 (q), 22,7 (t), 25,4 (t), 25,9 (t), 29,3 (t), 29,4 (t), 29,5 (t), 29,6 (t), 29,7 (t), 29,78 (t), 29,8 (t), 31,9 (t), 32,6 (t), 32,7 (t), 33,1 (t), 34,5 (t), 51,8 (t), 61,3 (t), 72,4 (d), 72,5 (d), 75,7 (d), 176,0 (s).