Đối tƣợng nghiên cứu của Luận văn là lá và cành của cây Ngải Nhật (Artemisia japonica Thunb., Asteraceae) đƣợc thu thập tại tỉnh Hòa Bình vào tháng 7 năm 2012.
Mẫu cành được cắt thành các đoạn 5 cm (đường kính 5 mm) và mẫu lá được phơi khô và sấy ở 50 oC. Mẫu lá sau khi sấy khô đƣợc nghiền thành bột mịn.
4.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGẢI NHẬT
Các hợp chất đƣợc sinh tổng hợp trong thực vật có các tính chất đa dạng do đó phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp chất thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn. Nhằm đạt đƣợc một sự làm giàu sơ bộ các hợp chất hữu cơ theo độ phân cực vào trong các phần chiết riêng biệt, cành và lá của cây Ngải Nhật đã đƣợc xử lý theo một quy trình chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng, sau đó các hợp chất hữu cơ đƣợc phân tách chọn lọc vào các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần.
Lá (bột mịn) và cành khô của cây Ngải Nhật đƣợc ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày, sau đó lọc thu dịch lọc MeOH; quy trình này đƣợc lặp lại 3 lần. Gộp các dịch MeOH lại và cất loại kiệt MeOH dưới áp suất giảm cho một phần chiết MeOH (kí hiệu tương ứng là AJL và AJC). Để phân tách phần chiết MeOH thành các nhóm chất theo độ phân cực, phần chiết này đƣợc chiết hai pha lỏng lần lượt giữa nước với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, điclometan và EtOAc để cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng. Làm khô các dịch chiết này bằng Na2SO4 rồi cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm để thu nhận các phần chiết hữu cơ. Qui trình này phân tách các hợp chất hữu cơ trong cành và lá cây Ngải Nhật thành 4 lớp: lớp các hợp chất tan trong n-hexan (AJLH, AJCH) có các
chất tan trong điclometan (AJLD, AJCD có các hiệu suất chiết 2,89% và 0,73%), lớp các hợp chất tan trong etyl axetat (AJLE, 0,68%) và cuối cùng là các hợp chất phân cực tan trong nước (AJLW, 0,62%). Sự phân tách này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn các phương pháp sắc ký khi phân tích định tính và định lượng cũng nhƣ phân lập các chất tinh khiết có trong các phần chiết.
Qui trình điều chế các phần chiết đƣợc nêu trong Sơ đồ 4.1.
Nguyên liệu thực vật (lá hoặc cành)
Dịch nước
Phần chiết n-hexan
(AJLH, AJCH)
Phần chiết EtOAc
(AJLE)
Phần chiết CH2Cl2
(AJLD, AJCD)
Phần chiết nước
(AJLW, AJCW)
1. Chiết bằng n-hexan 2. Cất loại n-hexan
loại kiệt n-hexan, 60 °C
Sơ đồ 4.1: Quy trình điều chế các phần chiết từ lá và cành cây Ngải Nhật 1. Ngâm chiết với MeOH (4 ngày, 3 lần) 2. Lọc, tách bã nguyên liệu
3. Cất loại MeOH
1. Chiết với CH2Cl2 2. Cất loại CH2Cl2
1. Chiết với EtOAc 2. Cất loại EtOAc
Cất loại nước, 100 °C Dịch nước
Dịch nước
Dịch nước
4.3 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÀNH VÀ LÁ CÂY NGẢI NHẬT 4.3.1 Phân tách phần chiết lá n-hexan (AJLH)
Phần chiết lá n-hexan (AJLH) (40 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63 -200 àm), rửa giải với n-hexan và hệ dung mụi gradient n-hexan-axeton 49:1, 29:1, 19:1, 12:1, 9:1, 3:1, và 1:1 (v:v). Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 11 nhóm phân đoạn từ AJLH1 đến AJLH11. Các nhóm phân đoạn đƣợc rửa bằng dung môi, tinh chế bằng sắc ký cột Mini-C trên silica gel và kết tinh lại cho các chất AJLH4 (52 mg), (AJLH5.1 (8,8 mg), AJLH 5.3 (125,9 mg) ≡ AJLH6 (36 mg), và AJLH82.1 (7,5 mg).
Quy trình phân tách các phần chiết lá n-hexan đƣợc trình bày ở Sơ đồ 4. 2.
4.3.2 Phân tách phần chiết lá điclometan (AJLD)
Phần chiết lá điclometan (AJLD) (40 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm) rửa giải với n-hexan và hệ dung mụi gradient n-hexan-axeton 49:1, 19:1, 12:1, 9:1, 6:1, và 3:1 (v:v). Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 12 nhóm phân đoạn từ AJLD1 đến AJLD12. Các nhóm phân đoạn đƣợc rửa với các dung môi, tinh chế bằng Mini-C trên silica gel và kết tinh lại cho các chất AJD56.1 (8,5 mg), AJLD56.2 (2,7 mg), AJLD8 (9 mg), AJLD9 (9 mg), và AJLD10 (1,8 mg).
Quy trình phân tách các phần chiết lá điclometan đƣợc trình bày ở Sơ đồ 4.3.
4.3.3 Phân tách phần chiết cành n-hexan và điclometan (AJCHD)
Phần chiết cành n-hexan và điclometan (AJCHD) (25 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm), rửa giải với n- hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 3:1, và 1:1 (v:v). Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 7 nhóm phân đoạn từ AJCHD1 đến AJCHD7. Các nhóm phân đoạn đƣợc rửa bằng dung môi thích hợp, tinh chế bằng Mini-C trên silica gel và kết tinh lại thu đƣợc chất AJCHD2.2 ≡ AJLH4 (2,3 mg), AJCHD ≡ AJLH 5.3 ≡ AJLH6 (64 mg), AJCHD5.2 ≡ AJLH82.1 (3,3 mg) và AJCHD6 (24 mg).
Quy trình phân tách các phần chiết cành n-hexan và điclometan đƣợc trình bày ở Sơ đồ 4.4.
Sơ đồ 4.4: Phân tách phần chiết cành n-hexan và điclometan (AJCHD)
4.4 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP
Từ các phần chiết lá và cành nhỏ cây Ngải Nhật các hợp chất 1- pentatricontanol (AJLH4), axit tricosanoic (AJLH5.1), β-sitosterol (AJL.H5.3, AJLH6, AJCHD2.2), 24(R)-cycloart-25-en-3β,24-diol (AJLH8.2.1a) và 24(S)- cycloart-25-en-3 β,24-diol (AJLH8.2.1b), 23(Z)-cycloart-23-en-3,25-diol (AJLH.8.2.2), artemisidiol A (AJLD8), eupatorin (AJLD9), (5,4'-dihydroxy- 6,7,3',5'-tetramethoxyflavon (AJLD10), ceramid A (AJLD56.2), và ceramid B (AJCHD6) đã đƣợc phân lập.
4.4.1 1-Pentatricontanol (AJLH4)
Hợp chất AJLH4 được phân lập từ phần chiết n-hexan (AJLH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,5 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v).
Trên phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AJLH có sự xuất hiện tín hiệu của một nhóm metyl bậc một ở H 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 35-CH3), các nhóm metylen của một mạch ankyl ở H 1,26 (64H, s br) và 1,57 (2H, quintet, J = 7,0 Hz), và một nhóm hydroxymetylen ở H 3,64 (2H, t, J = 6,5 Hz). Từ phổ 1H-NMR, số nhóm metylen có trong AJLH4 đã đƣợc xác định là 34. Do đó, cấu trúc của AJLH4 đã đƣợc xác định là 1-pentatriacotanol.
4.4.2 Axit tricosanoic (AJLH5.1)
Hợp chất AJLH5.1 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (AJLH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v:v).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AJLH5.1 xác định sự có mặt của một nhóm ankyl mạch dài qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một nhóm metyl cuối mạch ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 23-CH3) và các nhóm metylen dưới dạng một tín hiệu singlet dải rộng ở δH 1,25 (38H, s br) và 1,60 (2H, quintet, J = 7,0 Hz). Sự có mặt một tín hiệu nhóm metylen ở δH 2,34 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2-CH2) cho thấy nhóm này phải liên kết với một nhóm axit cacboxylic. Các dữ kiện phổ 1H-NMR đã xác định cấu trúc axit béo của AJLH5.1. Mạch ankyl đã đƣợc xác định dựa trên phổ 1H- NMR là chứa 21 nhóm CH2. Do đó, AJLH5.1 đã đƣợc xác định là axit tricosanoic.
4.4.3 β-Sitosterol (AJLH6)
Hợp chất AJLH6 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (AJLH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,45 (TLC, silica gel, n-hexan-axteton 9:1, v:v).
Chất AJLH6 đƣợc xác định là β-sitosterol dựa trên các phân tích TLC và co-TLC với chất chuẩn β-sitosterol.
4.4.4 24(R)-Cycloart-25-en-3β,24-diol (AJLH8.2.1a), và 24(S)-Cycloart-25-en-3 β,24-diol (AJLH8.2.1b).
Hai chất AJLH8.2.1a và AJLH8.2.1b đã đƣợc phân lập từ phần chiết n- hexan (AJLH) trong một hỗn hợp khó phân tách dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,35 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v:v).
HO
CH2CH3
1 2 3
4
5 6 7
8 9 10
11 12
13
14 15
16 17 18
19
20 21
22 23
24 25
26 27
28 29
H
AJLH6
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của hỗn hợp 2 chất AJLH8.2.1a và AJLH8.2.1b cho thấy sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân proton của một nhóm metylen đặc trưng của vòng cyclopropan ở δ H 0,33 và 0,55 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 4,0 Hz, H-19a và H-19b); 4 nhóm metyl singlet ở δ H 0,81 (3H, s, 28-CH3), 0,89 (3H, s, 30-CH3), 0,97 (6H, s, 18-CH3, 29-CH3), và 1,73 (3H, s, 27-CH3); một nhóm metyl doublet ở δ H 0,88 (3H, d, J = 6,0 Hz, 21-CH3); và một nhóm oximetin ở δ H 3,28 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,0 Hz, H-3).
Các phổ 13C-NMR (CDCl3) và DEPT (CDCl3) của hỗn hợp 2 chất AJLH8.2.1a và AJLH8.2.1b khi đƣợc so sánh với phổ của 23(Z)-cycloart-23-en- 3β,25-diol (AJLH8.2.2) cho thấy sự giống nhau ở phần vòng của khung cycloartan của các chất AJLH8.2.1a và AJLH8.2.1b. Sự khác biệt đƣợc thể hiện rõ ở phần mạch nhánh của khung cycloartan với sự cộng hưởng của hai tín hiệu của hai nhóm methylen nối đôi ở δH 4,83 (1H, s)/4,92 (1H, s) và 4,83 (1H, s)/4,93 (1H, s) và của một nhóm oximetin ở δH 4,02 (1H, t, J = 6,0 Hz, 7,5 Hz, H-24) trên phổ 1H-NMR.
Các dữ kiện này cho thấy mạch nhánh của các cycloartan này có sự thế 25-en-24- diol [42] và AJLH8.2.1a và AJLH8.2.1b là hỗn hợp các C-24 epime của cycloart- 25-en-3β,24-diol.
Sự nhận biết các đồng phân 24R và 24S đƣợc dựa trên các tín hiệu cộng
17,6 (q, C-27), 18,3 (q, C-21), 31,5 (t, C-23), 31,98 (t, C-22), 35,93 (d, C-20), 76,4 (d, C-24), 111,4 (t, C-26), và 147,8 (s, C-25) còn của đồng phân 24S cộng hưởng ở δ C 17,2 (q, C-27), 18,3 (q, C-21), 31,7 (t, C-23), 31,98 (t, C-22), 35,96 (d, C-20), 76,7 (d, C-24), 110,9 (t, C-26), và 147,5 (s, C-25) [29]. Các dữ kiện phổ của (24RS)-cycloart-25-en-3β,24-diol hoàn toàn phù hợp với các dữ kiện đƣợc công bố cho các chất đƣợc phân lập từ Euphorbia humifusa [42] .
4.4.5 23(Z)-Cycloart-23-en-3,25-diol (AJLH.8.2.2)
Hợp chất AJLH8.2.2 đã được phân lập từ phần chiết n- hexan (AJLH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,30 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v:v).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của AJLH8.2.2 cho thấy sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân proton của một nhóm metylen đặc trưng của vòng cyclopropan ở δH 0,32 và 0,55 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 4,5 Hz, H-19a và H-19b); 6 nhóm metyl singlet ở δH 0,81 (3H, s, 28-CH3), 0,88 (3H, s, 30-CH3), 0,96 (6H, s, 18-CH3, 29-CH3), và 1,31 (6H, s, 26-CH3, 27-CH3); một nhóm metyl doublet ở δH
0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3); và một nhóm oximetin ở δH 3,38 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,0 Hz, H-3). Ngoài ra còn có một tín hiệu cộng hưởng hai proton ở δH 5,59 (2H, s br, H-23, H-24) của các proton olefinic.
Phổ 13C-NMR/DEPT (CDCl3) của AJLH8.2.2 cho thấy chất này có cấu trúc của một tritecpenoit dãy cycloartan. Ngoài các tín hiệu của 7 nhóm metyl ở δC 14,0 (q, C-29), 18,1 (q, C-18), 18,3 (q, C-21), 19,3 (q, C-28), 25,4 (q, C-30), 29,99 (2 q, C-26, C-27); 10 nhóm metylen ở δC 21,1 (t, C-6), 26,1 (t, C-7), 26,5 (t, C-11), 28,1 (t, C-16), 29,9 (t, C-19), 30,4 (t, C-2), 31,9 (t, C-1), 32,8 (t, C-12), 35,6 (t, C- 15), và 39,1 (t, C-22); 4 nhóm metin ở δC 36,4 (d, C-20), 47,1 (d, C-5), 47,9 (d, C- 8), và 52,0 (d, C-17); và 5 cacbon bậc bốn ở δC 20,0 (s, C-9), 26,0 (s, C-10), 40,5 (s, C-4), 45,3 (s, C-13), và 48,8 (s, C-14) phổ 13C-NMR/DEPT của AJLH8.2.2 đã xác định đƣợc 2 cacbon mang nhóm chức oxi bao gồm một cacbon bậc ba ở δC 70,8 (s, C-25) và một cacbon bậc ba ở δC 78,9 (d, C-3), và một nối đôi thế hai lần ở δC 125,6 (d, C-23) và 139,4 (d, C-24). Nhóm oximetin ở δH 3,38 đƣợc giả thiết ở vị trí C-3 xuất phát từ con đường sinh tổng hợp các tecpenoit từ squalen-2,3-oxit và độ chuyển dịch hóa học cacbon-13 (δC 78,9) và hằng số tương tác (dd, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz) của nhóm oximetin này cho thấy nó phải được định hướng β trong cấu trúc cycloartan. Cacbon bậc ba mang oxi còn lại (δC 70,8) đƣợc xác định ở vị trí C-25 do sự phù hợp với sự xuất hiện của 2 nhóm metyl gắn với cacbon mang oxi ở δH 1,31 (6H, s) trên phổ 1H-NMR.
Khi xem xét các cấu trúc của các chất cycloartan tương tự phổ 1H-NMR của AJLH8.2.2 hoàn toàn giống với của cả chất cycloart-5-en-3β,25-diol (nối đôi 5,6) đƣợc phân lập từ Triticum aestivum [11] và 23(Z)-cycloart-23-en-3β,25-diol (nối đôi 23,24) đƣợc phân lập từ Euphorbia humifusa [42]. Tuy nhiên sự phù hợp của các dữ kiện phổ 13C-NMR và DEPT với chất sau đã xác định cấu trúc của AJLH8.2.2 là 23(Z)-cycloart-23-en-3β,25-diol. Dạng hình học (Z) của nối đôi 23,24 đã làm cho cả 2 tín hiệu proton của H-23 và H-24 cộng hưởng ở cùng một tần số và tạo thành một tín hiệu hai proton dải rộng. Hợp chất có cấu hình (E) của nối đôi
23,24 cũng đã đƣợc phân lập từ Pomatosace filicula và có sự khác biệt rõ rệt về giá trị độ chuyển dịch hóa học cacbon-13 của C-23 và C-24 [28].
4.4.6 Chất mới Artemisidiol A (AJLD8)
Hợp chất AJLD8 đã được phân lập từ phần chiết lá điclometan (AJLD)dưới dạng bột vô định hình màu trắng Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n- hexan- EtOAc 3:1, v:v), [α]23D +111,3(c 0,12, CH3OH).
Công thức phân tử của chất AJLD8 đã đƣợc xác định là C18H26O6 bằng phổ khối lƣợng ion hóa phun bụi điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) (m/z 361,1623 [M + Na]+).
Phổ IR cho dải hấp phụ của nhóm hydroxy ở νmax 3329 cm–1, nhóm cacbonyl ester ở 1733 và1712 cm–1, và liên kết đôi ở 1627 cm–1.
Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AJLD8, các tín hiệu cho một bộ khung 15 cacbon, một nhóm metoxy [H 3,79 (3H, s); C 52,1 (q)], và một nhóm axetoxy [H 1,95 (3H, s); C 170,4 (s) và 21,1 (q)] đã đƣợc xác định. Khung cacbon của AJLD8 bao gồm một nhóm metyl bậc bốn [H 0,93 (3H, s); C 17,4 (q)], một nhóm metyl vinylic [H 1,91 (3H, s); 24,6 (q)], 3 nhóm oximetin [H 3,38 (1H, d, J = 4,0 Hz); C 73,2 (d), 4,06 (1H, dd, J = 10,5 Hz, 9,5 Hz); 71,5 (d), và 5,41 (1H, ddd, J = 12,0 Hz, 11,0 Hz, 5,0 Hz); 70,2 (d)], một liên kết đôi thế ba lần [H 5,3 (1H, s br );
C 119,9 (d) và 134,5 (s)], và một liên kết đôi dạng exometylen [H 5,74 (1H, s) và 6,34 (1H, s); C 128,8 (t) và 138,3 (s)], và một nhóm cacbonyl ester [C 167,3 (s)], cho thấy một cấu trúc dạng eudesman của AJLD8. Do đó, dựa trên cơ sở các dữ
liệu phổ MS và NMR cấu trúc của AJLD8 đƣợc xác định là dạng eudesma- 3,11(12)-dien.
Vị trí của 3 nhóm oximetin, nhóm metoxy và hóa lập thể của AJLD8 đã được xác định qua các tương tác 1H-1H (NOESY) và 1H-13C (HSQC và HMBC) (Hình 3). Nhóm metoxy ở H 3,79 đã đƣợc xác định là một phần của nhóm metyl ester qua tương quan HMBC giữa nhóm metoxy này và C-13 (C 167,3). Nhóm oximetin ở H 3,38 đã được xác định tại C-1 qua tương tác HMBC giữa H3-15 (H
0,93) và C-1 (C 73,2), và giữa H-1 (H 3,38) và C-3 (C 119,9) và C-5 (C 45,1).
Nhóm oximetin thứ hai ở H 4,06 (dd) được liên kết vào C-6 qua tương tác HMBC giữa H-7 (H 2,51) và C-6 (C 71,5). Nhóm oximetin ở H 5,41 (ddd) đã đƣợc xác định ở C-8 vì vị trí này các tương tác proton-proton với 3 proton khác. Tương quan HMBC giữa proton này (H 5,41) và nhóm axetoxy (C 170,4)và C-11 (C 138,3), giữa H2-12 (H 5,74/6,34) và C-7 (C 57,4), và giữa H2-9 (H 1,65/1,88) và C-8 xác định sự liên kết nhóm axetoxy vào C-8.
Phân tích các hằng số tương tác và phổ NOESY đã xác định hóa lập thể của AJLD8. NOE giữa H3-15 và H-1, H-6, và H-8 khẳng định sự định hướng α của nhóm hydroxy tại C-1 và C-6, và nhóm axetoxy tại C-8. Giá trị JH-1/H-2 (d, J = 4,0 Hz) là đặc trưng của một He, cho thấy sự định hướng trục axial của nhóm hydroxy ở C-1. Mối tương quan trans-diaxial cũng thể hiện rõ giữa H-5 và H-6 (JH-5/H-6 = 10,5 Hz) và giữa H-8 và H-9α (JH-8/H-9α = 12,0 Hz). Sự định hướng β của mạch nhánh ở C-7 và sự định hướng α của H-5 đã được xác định qua các tương tác NOE giữa H-5 và H-7 và H-9 α. Do đó, cấu trúc của AJLD8 đã đƣợc xác định nhƣ biểu diễn và hợp chất này được đặt tên thông thường là artemisidiol A. Chất AJLD8 là một hợp chất thiên nhiên mới.
Hình4. 1: Các tương tác HMBC và NOESY của AJLD8 4.4.7 Eupatorin (AJLD9)
Hợp chất AJLD9 đã được phân lập từ phần chiết lá điclometan (AJLD) dưới dạng chất bột vô định hình màu vàng, Rf = 0,55 (TLC, silica gel, CH2Cl2-MeOH 19:1, v:v).
Các phổ 13C-NMR và DEPT của chất AJLD9 cho các tín hiệu của 18 cacbon, bao gồm 8 cacbon thế vòng benzen (8s) (δC 106,1, 122,8, 132,6, 147,7, 150,1, 152,7, 158,9, và 164,7), 5 nhóm metin (5d) (δC 90,9, 103,9, 109,0, 115,6, và 120,8), và 3 nhóm metoxy (3q) (δC 56,2, 56,4, và 60,9). Các tín hiệu trong khoảng độ chuyển dịch hóa học từ δC 90,9 đến 164,7 thuộc về các cacbon vòng thơm và tín hiệu ở δC 182,9 thuộc về một nhóm cacbonyl liên hợp của một khung flavonoit. Các
OAc OH
OH H
CO2CH3 H
H
H H H H
H
H H O
OH
OH H
O
H3CO O
flavon của AJLD9. Tín hiệu proton singlet của vòng A ở δH 6,59 (1H, s) cho thấy vòng này đã bị thế oxi ba lần. Các tín hiệu của vòng B δH 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,36 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 7,49 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz) cho thấy vòng B thế 1',3',4'-trioxy. Khi so sánh các giá trị độ chuyển dịch hóa học của vòng A và của flavon thế [38], vòng A đã đƣợc xác định là thế 5,6,7-trioxy. Sự có mặt của 3 nhóm metoxy trên các phổ 1H-NMR và 13C-NMR và sự gán một nhóm hydroxy ở C-5 (do độ chuyển dịch δC-4 ở 182,9 dưới ảnh hưởng của liên kết hydro nội phân tử) cho thấy AJLD9 có thể có các dạng thế sau 5,4'-dihydroxy-6,7,3'-trimetoxy (chất cirsilineal), 5,3'-dihydroxy-6,7,4'-trimetoxy (chất eupatorin), và 5,7-dihydroxy- 6,3',4'-trimetoxy (chất eupatilin) [39, 23].
Trên cơ sở so sánh các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR với tài liệu tham khảo cấu trúc của chất AJLD9 đã đƣợc xác định là eupatorin [39].
4.4.8 5,4'-Dihydroxy-6,7,3',5'-tetrametoxyflavon (AJLD10)
Hợp chất AJLD10 đã đƣợc phân lập từ phần chiết lá điclometan (AJLD) dưới dạng chất bột vô định hình màu vàng, Rf = 0,50 (TLC, silica gel, CH2Cl2- MeOH 19:1, v:v).
Các phổ 13C-NMR và DEPT của chất AJLD10 cho các tín hiệu của 19 cacbon, bao gồm 8 cacbon thế vòng benzen (8s) (δC 106,1, 121,9, 132,7, 139,5, 148,0 (2 s), 153,5, và 159,1), 4 nhóm metin (4d) (δC 91,1, 104,0, và 104,3), và 4 nhóm
chuyển dịch hóa học từ 91,1 đến 164,8 thuộc về các cacbon vòng thơm và tín hiệu δC
182,9 (s) là của một nhóm cacbonyl liên hợp của một khung flavonoit. Các tín hiệu δC 104,3 và δH 6,61 (s) của H-3 cho thấy cấu trúc flavon của AJLD10 và độ chuyển dịch hóa học của C-4 ở δH 128,9 xác định sự tồn tại của nhóm 5-OH. Các tín hiệu phổ này cho thấy vòng A của AJLD10 không có sự thay đổi so với phổ của chất AJLD9 (eupatorin), tuy nhiên, sự đối xứng của vòng B qua hai tín hiệu của hai proton H-2' và H-6' (δH 6,61, 2 s) và hai nhóm metoxy 3'-OCH3 và 5'-OCH3 (δH
3,99, 2 s) đã xác định dạng thế (4'- hydroxy-3',5'-dimetoxy) của vòng B.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR cấu trúc của chất AJLD10 đã đƣợc xác định là 5,4'-dihydroxy-6,7,3',5'-tetramethoxyflavon phù hợp với các phổ của tài liệu tham khảo [39].
4.4.9 Ceramid A (AJLD56.2) và Ceramid B (AJCHD6)
Các chất AJLD56.2 và AJCHD6 đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng từ phần chiết lá điclometan (AJLD), và phần chiết cành n-hexan và điclometan (AJCHD) với các giá trị Rf = 0,43 và 0,35 (TLC, silica gel, n-hexan- EtOAc 3:1, v:v)
HN O
OH
CH3
HO CH3
( )m
( )n OH
OH
AJLD5.6.2 AJCHD6
1 2
3 4 1'
2'
Phổ 1H-NMR của các chất AJLD56.2 và AJCHD6 có những điểm giống nhau:
2 nhóm metyl cuối mạch [δH 0,88 (t, 6H, J = 7,0 Hz)] liên kết với hai mạch ankyl dài[δ 1,26 (m+n)CH , s br], 3 nhóm oximetin [δ 3,55 (2H, s br), và 4,04 (1H, dd,
3,81 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,5 Hz)], và một nhóm metin liên kết với nguyên tử nitơ của nhóm amit trong một cấu trúc ceramid [4,09 (1H, s br)]. Giả thiết về cấu trúc ceramid của AJLD56.2 và AJCHD6 đã đƣợc khẳng định qua phân tích phổ 13C- NMR và DEPT của AJCHD6. Phổ 13C-NMR của AJCHD6 cho thấy sự có mặt một nhóm cacbonyl amit ở δC 176,0 (s), 3 nhóm oximetin ở δC 75,7 (d), 72,5 (d), và 72,4 (d), một nhóm oximetylen ở δC 61,3 (t), và nhóm metin liên kết với nguyên tử nitơ của nhóm amit ở δC 51,8 (d). Các mạch ankyl dài đƣợc xác định qua các tín hiệu cacbon-13 của nhóm metyl ở δC 14,1 (q), và các nhóm metylen mạch dài từ δC
22,7-34,5 (tất cả t).
Do đó, trên cở sở các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR cấu trúc của các chất AJLD56.2 và AJCHD6 đã đƣợc xác định là các chất ceramid A và B. Tuy nhiên, các chiều dài mạch cacbon của các mạch axit béo và bazơ amino cần đƣợc tiếp tục xác định qua phân tích các dữ kiện phổ khối lƣợng MS.