Real time PCR là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của một mẫu ADN [32].
Phản ứng qRT-PCR (Real-time reverse transcription PCR) được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua quá trình tổng hợp cADN từ ARN bằng enzyme phiên mã ngược. cADN sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Sản phẩm của RT-PCR có thể được định lượng nhờ điện di trên gel agarose sau khi chạy phản ứng PCR hoặc sử dụng phản ứng Real-time PCR. Real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đánh dấu huỳnh quang, nồng độ sản phẩm được phân tích, dựa trên cường độ tín hiệu huỳnh quang, từ đó tính toán được nồng độ khuôn ban đầu [32].
23
Ứng dụng: qRT – PCR được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gene, để xác định sự biểu hiện của một gen hoặc để xác định trình tự của một bản sao mã ARN, bao gồm cả vùng khởi đầu và kết thúc phiên mã.
1.6.2. RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang
Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường là SYBR Green, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất cả các chuỗi ADN kép và phát huỳnh quang, sau mỗi chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăng cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng. Nhược điểm của chất huỳnh quang là có thể gắn vào các sản phẩm tự mồi gây nên hiện tượng nhiễu, làm giảm độ chính xác trong phân tích định lượng kết quả trình tự đích cần khuếch đại [32].
Phản ứng được thực hiện trong một máy chu kỳ nhiệt như bình thường, trừ việc thêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm chỉ phát quang khi gắn với chuỗi ADN kép, và đầu dò sẽ đo mức huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Nếu kèm gam chuẩn ngoài thì phản ứng có thể định lượng được [32].
1.6.3. RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đáng tin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất. Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dò chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát hiện (hiện tượng FRET). Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực giữa hai đoạn mồi để định lượng chỉ những ADN chứa trình tự đầu dò, do vậy làm tăng đáng kể độ đặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả một số sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Khả năng này còn cho phép làm thử nghiệm đa mồi khi sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau.
24
Hình 1.9. Sơ đồ real-time PCR TaqMan [32].
Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chất chặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ không phát quang. Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau giữa chất mang và chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa, chất huỳnh quang không còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tín hiệu phát quang này sẽ được máy đo lại. Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng thì lượng chất huỳnh quang tự do được giải phóng ra cũng tích tụ lại ngày càng nhiều.
PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh quang;
Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dò đều gắn đặc hiệu vào ADN đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vị trí các mồi, và khi taq polymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme này phá hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn và do đó làm tăng lượng chất huỳnh quang ở dạng tự do. Chất huỳnh quang được đo bằng máy real-time PCR, lượng tăng trung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản phẩm và được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng.
25