Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen SOS1 32 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Các mẫu được nghiền trong nitơ lỏng, ARN tổng số được tách chiết bằng kit GeneJET Plant RNA purification Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.4.2. Xử lý DNase I, kiểm tra chất lượng ARN
Lá của cả cây đối chứng và cây xử lý mặn đã được thu hoạch sau 1, 3 và 24 giờ sau khi xử lý mặn và ngay lập tức làm lạnh bằng Ni tơ lỏng để phân tích mức độ biểu hiện và phân tích sự methyl hóa. ARN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ ARN bằng đo quang phổ (NanoDrop ND-1000 UV-Vis quang phổ, Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) sau đó được loại bỏ ADN bằng xử lý với DNase I (Thermo Fisher Scientific, USA) và được kiểm tra việc loại bỏ ADN hệ gen bằng qRT- PCR sử dụng mồi khuếch đại trình tự intron của gen OsHKT2; 1 (LOC_Os06g48810).
Các mẫu ARN thu được cuối cùng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA
1 μg ARN tổng số được chuyển thành cDNA sử dụng Kit Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, USA) với mồi OligodT. Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.4.4. Phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu
Tổng thể tớch của mỗi phản ứng Real-time PCR định lượng là 20 àl, bao gồm SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA và một cặp primer thiết kế đặc hiệu cho gen SOS1 hoặc gen Actin 1 với nồng độ sau cùng là 0,4
33
àM. Cỏc phản ứng được thực hiện trờn mỏy AB ABI Fast 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Chu trình chạy phản ứng bao gồm giai đoạn biến tính ở 95°C trong 10 phút, giai đoạn bắt cặp trong 40 chu kỳ ở 95°C ( trong 15 giây) và giai đoạn kéo dài ở 60°C ( trong 1 phút) sử dụng đĩa 96 giếng. Tính đặc hiệu của phản ứng và kích thước chính xác của ADN khuếch đại được kiểm tra bằng điện di gel agarose và phân tích đường cong nóng chảy. Gen đối chứng Actin1, đã được sử dụng để so sánh sự khác biệt về lượng cDNA đầu vào.
2.2.4.5. Phân tích số liệu
Để kiểm tra độ đặc hiệu hay số sản phẩm được khuếch đại ở mỗi phản ứng, phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) được thực hiện bằng cách giữ ở nhiệt độ 95°C trong 15 giây trước khi gia tăng nhiệt đều từ 60°C lên 95°C.
Phương pháp delta Ct được sử dụng để so sánh tương đối mức độ biểu hiện gen ở các giống lúa khác nhau [35].
Phương pháp 2-∆∆Ct của Livak [35]
Đây là phương pháp dùng để nghiên cứu biểu hiện của một gen đột biến so với mẫu tế bào bình thường. Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm cần định lượng gen cần nghiên cứu ( Targer = Tg) và một gen tham chiếu hay gen đối chứng ( reference
= Ref) tức là gen mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu tế bào (Mẫu thí nghiệm được gọi là T và mẫu đối chứng được gọi là C).
Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gen Tg và gen Ref qua các thông số:
• Ct (T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích ( Tg) trong mẫu thí nghiệm (T),
• Ct (T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu thí nghiệm (T),
• Ct (C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu đối chứng (C),
• Ct ( C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu đối chứng (C).
Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa ( nomalized) chu kỳ ngưỡng của gen đích trên mẫu thí nghiệm ( T) và mẫu đối chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu:
Mẫu thí nghiệm : ∆Ct(T) = Ct (T/Tg) – Ct( T/Ref) Mẫu đối chứng : ∆Ct (C) = Ct (C/Tg) – Ct ( C/Ref)
34
Sau đó sẽ thường hóa ∆Ct mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ∆Ct (T) với ∆Ct (C)
∆∆Ct = ∆Ct(T) - ∆Ct (C)
Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng bằng 2-∆∆Ct
35