Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn đến mức độ biểu hiện gen SOS1
Phân tích biểu hiện gen SOS1 được thực hiện bằng cách sử dụng Realtime RT- PCR với 4 giống lúa tương ứng dưới điều kiện thường và độ mặn ở các thời điểm khác nhau (1, 3 và 24 giờ sau khi xử lý mặn) để xác định ảnh hưởng của stress mặn ngắn hạn đối với biểu hiện gen. Như thể hiện trong hình 3.9, biểu hiện gen SOS1 không thay đổi sau đó giảm theo thời gian đối với Pokkali đồng thời tăng lên sau 3 giờ xử lý mặn trước
46
khi giảm sau 24 giờ xử lý mặn đối với Nếp Nõn Tre. Đặc biệt, sau 24 giờ xử lý mặn, cả hai giống chịu mặn cho thấy sự giảm biểu hiện gen SOS1, trái ngược với các giống mẫn cảm, Nipponbare và Dâu Ấn Độ, có sự gia tăng biểu hiện của gen SOS1 sau 24 giờ.
Hình 3.9. Biểu hiện của gen SOS1 ở 4 giống lúa được phân tích bằng phương pháp realtime PCR định lượng.
Quan sát giá trị Fold change thu được của mỗi mẫu lúa tại từng thời điểm ta có thể thấy:
Tại thời điểm thu mẫu 1 giờ sau khi xử lý mặn: Biểu hiện của gen SOS1 ở giống lúa Pokkali không đổi, Nếp Nõn Tre và Dâu Ấn Độ tăng dần trong khi giống Nipponbare lại biểu hiện giảm
Tại thời điểm thu mẫu 3 giờ sau khi xử lý mặn: Biểu hiện của gen SOS1 ở giống Pokkali và Dâu Ấn Độ giảm trong khi hai giống còn lại Nếp Nõn Tre và Nipponbare thì tăng lên, đặc biệt tăng mạnh ở giống Nipponbare
Tại thời điểm thu mẫu 24 giờ sau khi xử lý mặn: Biểu hiện của gen SOS1 ở giống Pokkali và Nếp Nõn Tre giảm trong khi hai giống Nipponbare và Dâu Ấn Độ lại tăng lên (tăng mạnh ở giống Dâu Ấn Độ).
47
Khi so sánh cùng một giống ở các thời điểm cho thấy: Ở Giống Pokkali: Biểu hiện của gen SOS1 ở Pokkali giảm dần sau mỗi thời điểm thu mẫu 1 giờ, 3 giờ và 24 giờ
Giống Nếp Nõn Tre: Biểu hiện của gen SOS1 tăng dần tại thời điểm 1 giờ và 3 giờ, sau đó giảm ở thời điểm 24 giờ
Giống Nipponbare: Biểu hiện của gen SOS1 ở Nipponbare giảm sau 1 giờ rồi tăng ở thời điểm 3 giờ, 24 giờ nhưng cao nhất là 3 giờ.
Giống Dâu Ấn Độ: Biểu hiện của gen SOS1 cũng tăng sau 1 giờ rồi giảm sau 3 giờ, tiếp tục tăng tại thời điểm 24 giờ.
Chúng tôi quan sát thấy, đối với nhóm lúa chịu mặn, sau 24 giờ biểu hiện của gen SOS1 có xu hướng giảm trong khi đó biểu hiện gen SOS1 của nhóm lúa mẫn cảm có xu hướng tăng lên.
• Thảo luận :
Stress mặn có thể làm sự thay đổi biểu hiện gen thông qua quá trình methyl hóa ADN [17]. Điều này đã được chứng minh rằng sự methyl hóa ADN trong promoter liên quan đến mức độ biểu hiện gen [61]. Methyl hoá trong promoter liên quan đến sự ức chế hoạt động của promoter bằng cách can thiệp vào việc gắn thêm các yếu tố phiên mã [47] do đó ảnh hưởng đến sự khởi đầu phiên mã. Mặc dù, chỉ có một vài nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng của methyl hóa ADN trong vùng mã hóa đối với sự biểu hiện gen, nhưng nó cho biết sự methyl hóa ADN trong vùng mã của gen có ảnh hưởng tiêu cực đến sự biểu hiện gen ở thực vật [24, 59]. Methyl hóa ADN trong vùng mã hóa của gen có thể ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của gen bằng cách kiểm soát sự kéo dài phiên mã [19]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá sự methyl hóa trong vùng trình tự mã hóa của gen SOS1 kết hợp với đánh giá mức biểu hiện của gen này. Tuy nhiên, kết quả cho cho thấy không có mối liên hệ nào giữa tình trạng methyl hóa trong trình tự mã hóa của gen SOS1 với mức biểu hiện của gen.
SOS1 (salt overly sensitive) đã được chứng minh là có liên quan đến khả năng chịu mặn ở thực vật bằng cách thải loại ion Na+ ra khỏi tế bào. Trong nghiên cứu này, sau 24 giờ xử lý mặn, hai giống lúa chịu mặn (Pokkali, Nếp Nõn Tre) cho thấy mức biểu hiện gen SOS1 giảm, trong khi hai giống mẫn cảm mặn (Nipponbare, Dâu Ấn Độ) đáp ứng với điều kiện mặn bằng cách tăng mức độ biểu hiện của gen này. Lý do để giải thích cho
48
kết quả mâu thuẫn này là do thí nghiệm biểu hiện đã được tiến hành với mẫu lá. Với nhóm cây mẫn cảm, mức biểu hiện gen SOS1 tăng lên giúp cây thải loại ion Na+ qua các tế bào mô lá nhiều, còn với nhóm cây chịu mặn biểu hiện SOS1 giảm đi do gen SOS1 hoạt động thải loại Na+ ngay từ phần rễ của cây.
49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
1. Đã đánh giá được đặc điểm kiểu hình của 4 giống lúa sử dụng phương pháp đo điểm kiểu hình lá, kết quả chúng tôi đã xác định được 2 giống lúa Nếp Nõn Tre và Dâu Ấn Độ tương ứng thuộc 2 nhóm kháng mặn và giống mẫn cảm mặn. Đối với giống Pokkali và Nếp Nõn Tre, cho thấy không có ảnh hưởng đáng kể bởi điều kiện mặn đến chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll lá và diện tích lá trong khi những đặc điểm này lại bị giảm đáng kể khi quan sát ở các giống mẫn cảm, Nipponbare và Dâu Ấn Độ.
2. Đã đánh giá mức độ methyl hóa ở hai vùng chứa exon thuộc gen SOS1 ở bốn giống lúa trong điều kiện bình thường và mặn nhân tạo bằng MSP-PCR và giải trình tự bisulfite cho thấy các đảo CG đều bị methyl hóa giống nhau ở bốn giống lúa trong cả hai điều kiện.
3. Phân tích mức độ biểu hiện của gen SOS1 bằng realtime RT-PCR cho thấy có sự thay đổi mức độ biểu hiện gen SOS1 ở lá của bốn giống lúa theo thời gian trong điều kiện mặn nhân tạo.
Kiến nghị
Từ các kết quả thu được trong nghiên cứu, chúng tôi có kiến nghị như sau:
1. Giải trình tự bisulfite toàn bộ vùng mã hóa và promoter của gen SOS1 để khảo sát sự methyl hóa toàn diện hơn.
2. Đánh giá mức độ biểu hiện gen SOS1 ở mẫu rễ.
50