*) Chất 1 (ò-sitosterol): phõn lập được từ phõn đoạn F3 của cặn dịch chiết CH2Cl2, điểm nóng chảy: 140-142°C, Rf = 0,81 hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (98:2). Phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại IR, MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR có so sánh với tài liệu cho phép kết luận chất 1 là ò- sitosterol [9] [27].
RO
1 2
3 5
6
29
21
20 22
23
24 25 26
27 28
7 8 9 11
12
13
14 15
16 17 18
19
10
1. ò- sitosterol R=H 2. ò- sitosterol-3-O-ò-D- glucopyranosit R=Glucose
4
*) Chất 2 (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit) phân lập được từ phân đoạn F5 của cặn dịch chiết CH2Cl2 bằng sắc ký cột nhanh (FC) chất hấp phụ silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (1:99-9:1). Chất thu được ở dạng vô định hình mầu trắng, điểm nóng chảy: 285-286°C, ESI- MS m/z 575 [M-H]-.
Phổ 1H-NMR của chất 2 xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm metyl tại δH 0,77; 0,81; 0,82; 0,83; 0,90 và 0,96 ppm trong đó có cặp tín hiệu dublet tại δ 0,82 (H-26) và δ 0,81 (H-27) cùng có hằng số tương tác J
=7,0 Hz là tương tác germinal của 2 nhóm metyl vị trí C-26 và C-27 gắn vào nhóm metin ở vị trí 25. Tín hiệu dublet tại δ 5,33 (J =5,0 Hz) là của nối đôi ở vị trí C5 - C6 cùng với một multiplet tại δ 3,46 (1H, m, H-3) cho thấy 2 là dẫn xuất của sitosterol. Tín hiệu của proton anomer tại δ 4,22 (J=7,0 Hz) cùng với vùng tín hiệu proton ở δ 4,39-4,85 ppm cho
thấy sự có mặt của 1 phân tử đường glucose trong phân tử hợp chất. Trên phổ 13C-NMR cũng cho thấy tín hiệu của cacbon anomer tại δ 100,7 và 5 tín hiệu của đường glucose tại δC 73,3; 76,4; 70,1; 76,7 và 60,1 ppm. Từ các phân tích trên cùng với phổ khối lượng EI-MS cho pic ion tại m/z 575 [M-H]- ứng với công thức phân tử C35H60O6 (M=576) và sự phù hợp với tài liệu đã công bố [9, 28] cho phép nhận dạng chất 2 là β-sitosterol-3-O- β-D-glucopyranosit hay daucosterol.
*) Hợp chất AP (3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone):
AP. 3,5,6,7,8,3',4',-heptamethoxy flavon H3CO O
OCH3
OCH3
5 6 7
3' 6'
5' 4'
2'
1' OCH3
4 OCH3
O OCH3
H3CO
8
2 3
Hợp chất AP thu được là dạng tinh thể hình kim, màu vàng, điểm nóng chảy 129-130oC, ESI-MS m/z 432 [M]+ (công thức phân tử:
C22H24O9,).
Trên phổ 1H-NMR không thấy tín hiệu cộng hưởng của các proton thơm của vòng A, cùng với sự xuất hiện nhóm tín hiệu singlet từ δ 3,96- 4,10 ppm là của các proton của các nhóm metoxy (OCH3) chứng tỏ vòng A bị metoxy hóa ở các vị trí 5, 6, 7 và 8 [29]. Trên phổ 1H-NMR còn có sự tách vạch đặc trưng của hệ thống spin ABX [30] với các hằng số tương tác J =2Hz và J =8Hz cho thấy vị trí 3’, 4’ ở vòng B của hợp chất flavonoit bị metoxyl hóa. Phù hợp với phổ 1H-NMR, trên phổ 13C-NMR các tín hiệu cacbon đều chuyển về vùng trường thấp do nối với oxi. Cụm
tín hiệu ở vùng từ δ 55,9 - 62,2 ppm là của cacbon của nhóm metoxy; tín hiệu của nhóm C=O (vị trí 4) tại δ 173,8 ppm.Việc gắn các số liệu phổ của hợp chất AP được phân tích từ phổ 1H, 13C-NMR một chiều và 2 chiều. Từ dữ liệu thu được, so sánh với tài liệu [29, 31, 32] xác định được hợp chất AP là 3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone. Hợp chất 3,5,6,7,8,3’,4’-heptamethoxyflavone đã được tìm thấy trong một số loài Citrus nhưng đây là lần đầu tiên được tách từ cây Long nha thảo. Hoạt tính ức chế khối u, chống oxy hóa khá tốt của hợp chất flavon này đã được một nhóm nghiên cứu ở Nhật công bố [33].
H3CO O
OCH3
OCH3
5 6 7
3' 6'
5' 4'
2'
1' OCH3
4 OCH3
O OCH3
H3CO
8 2
3
Hình 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP
Hình 2: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP
Hình 3: Phổ 13C-NMR của hợp chất AP
*) Hợp chất AP2 (5, 7, 3’- trihydroxy- 6, 4’,5’- trimetoxy flavon)
AP2. 5,7, 3'-trihydroxy-6,,4',5' trimetoxyflavon
HO O
OH
5 6 7
4
O H3CO
8
2
3
3'
6' 5'
4' 1'
2' OH
OCH3 OCH3
Hợp chất AP2 thu được là chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 289- 291oC, EI-MS m/z 359 [M-H]- (công thức phân tử C18H16O8).Phổ 1H- NMR của hợp chất AP2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của vòng A tại δ 8,11 (1H, s, H-2); δ 6,45 (1H, s, H-8) và tín hiệu nhóm metoxy ở vùng δ 3,88 ppm cho thấy vòng A là penta-substitued. Chỉ còn 1 cặp tín hiệu cộng hưởng tại 6,72 (d, J = 2Hz, H-2’); 6,70 (d, J = 2Hz, H-6’) và tín hiệu nhóm metoxy ở vùng δ 3,89, 3,83 ppm cho thấy vòng B có khả năng bị thế ở cả 3 vị trí 3’, 4’ và 5’. Phổ 13C-NMR cũng có sự phù hợp khi hầu hết các tín hiệu C đều dịch về phía trường thấp với nhóm carbonyl tại δ 182,3 và các tín hiệu nhóm metoxy tại δ 61,0 (OCH3-4’); 59,6 (OCH3-5’);
60,9 (OCH3-6). Việc gắn các số liệu phổ của hợp chất AP2 được phân tích từ phổ 1H, 13C-NMR một chiều và 2 chiều. Trên cơ sở dữ liệu thu được, so sánh với tài liệu [34, 35, 36] xác định hợp chất AP2 là 5,7,3’- trihydroxy - 6, 4’,5’- trimetoxy flavon.
Hợp chất 5,7,3’- trihydroxy - 6,4’,5’- trimetoxy flavon (irigenin) đã được tìm thấy trong một số loài thuộc họ Iridaceae và các nghiên cứu này đã công bố về hoạt tính ức chế ung thư và kháng viêm khá tốt của nó [34], song đây là lần đầu tiên hợp chất irigenin được phân lập từ cây Long nha thảo.
HO O
OH
5 6 7
4
O H3CO
8 2
3 3'
6' 5'
4' 1'
2' OH
OCH3 OCH3
Hình 4: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2
Hình5: Phổ 13C-NMR của hợp chất AP2
Hình6: Phổ HMBC hợp chất AP2
*) Hợp chất AP3 (ursolic axit)
HO
3. Ursolic acid
25 COOH
27
28 1
3
30
24
29
23 26 12
13
14
15 18
17
16 21 20 19
2
5 6
22
8 4 7
11
10 9
Chất AP3 được phân lập từ phân đoạn F4.2 của phần dịch chiết EtOAc, ở dạng chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 284-286oC.
Trên 1H-NMR thấy có tín hiệu của proton olephinic tại 5,12 ppm (1H, t, 3,5 Hz, H-12) và của 7 nhóm metyl với độ chuyển dịch hóa học trong vùng δH 0,65- 1,87 ppm đặc trưng của khung oleanen. Phù hợp với các tín hiệu từ phổ 1H-NMR, trên phổ 13C-NMR thấy có tín hiệu của cacbon olephinic ở δc 125.3 ppm (C-12), 138.0 ppm (C-13) và tín hiệu đặc trưng của nhóm cacboxylic axít ở δC 180,4 ppm. Các kết quả gán phổ
1H-NMR và 13C-NMR được trình bày ở bảng 1. Kết hợp phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu cho phép kết luận hợp chất AP3 là ursolic axít [37, 38].
Bảng 1 : Số liệu phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của ursolic axít
Vị trí δC δH (J=Hz) Vị trí δC δH (J=Hz)
1 38,5 16 24,0
2 26,6 17 47,6
3 78,6 3,07(1H, dd, 11,5; 4,5) 18 52,6 2,07 (1H, d, 11,5)
4 38,7 19 39,0
5 55,1 20 39,0
6 18,1 21 30,5
7 32,8 22 36,7
8 39,3 23 27,8 0,96 (3H, s)
9 47,6 24 15,1 0,65 (3H, s)
10 36,7 25 15,3 0,82 (3H, s)
11 36,7 26 16,6 0,69 (3H, s)
12 125,3 5,12 (1H, t, 3,5) 27 23,1 1,87 (3H, s)
13 138,0 28 180,4
14 41,9 29 16,7 0,74 (3H, d, 6,25)
15 27,8 30 20,8 0,86 (3H, d, 6,5)
*) Hợp chất AP4 (quercetin):
HO O
OH
OH
2
3
5 6 7
8 3'
6' 5'
4'
2'
1' OH
4
4. Quercetin O OH
Chất AP4 được phân lập từ phân đoạn F4.3 của phần dịch chiết EtOAc là tinh thể hình kim mầu vàng nhạt. Điểm nóng chảy 314-316oC.
Phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu tại δ 6,40 ppm (d, J = 2Hz, H- 8); và δ 6,20 ppm (d, J = 2Hz, H-6) chứng tỏ hợp chất thơm có 2 proton ở vị trí meta với nhau. Kiểu tín hiệu xuất hiện tại vùng δ 6,90 -- 7,75 ppm với hằng số tương tác J = 8Hz và J = 2Hz chứng tỏ vòng B có hai nhóm thế như ở vị trí C-3’ và C-.4’. Phổ 13C-NMR thấy xuất hiện 15 pic tương ứng với 15 cacbon của khung flavonoit, trong đó nhóm C=O tại δC 177,3 ppm, các vị trí tại C-5, C-7, C-3’ và C-4’ có sự dịch chuyển về phía trường yếu chứng tỏ ở đây có nhóm OH. Các kết quả gán phổ cộng hưởng từ hạt nhân được trình bầy ở mục 4.5, tr. 45 phần thực nghiệm.
Kết hợp phân tích các dữ kiện phổ và so sánh với tài liệu [39, 40]
cùng với thông tin từ phổ khối lượng (ESI-MS) với pic ion m/z 301 [M- H]- (công thức phân tử C15H10O7) cho phép kết luận chất AP4 là 2-(3,4- dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-on hay còn gọi là quercetin.
Hình phổ 1H-NMR của AP4
Hình phổ 13C-NMR của AP4
Quercetin có hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE) với mức độ phụ thuộc vào liều lượng sử dụng và giá trị IC50 (50% AchE) là 19,8 àM [6], Hoạt tớnh của Quercetin cũn cao hơn cả hoạt tớnh của dehydroevodiamine hydrochloride (DHED) cú giỏ trị IC50 là 37,8 àM [40].
*) Hợp chất AP5 (catechin)
HO O
OH
OH
2
3
5 6 7
8 3'
6' 5'
4'
2'
1' OH
4
5. Catechin OH
Chất AP5 được phân lập từ phân đoạn F5 của phần dịch chiết EtOAc, dạng chất rắn màu nâu nhạt, điểm nóng chảy 178oC. Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion tại m/z 289 [M-H]- tương ứng công thức phân tử C15H14O6. Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 15 pic tương ứng với 15 cacbon của khung flavonoit. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton thơm tại δ 5,84 ppm (d, J = 1,5Hz, H-8) và δ 5,81 ppm (d, J = 1,5Hz, H-6) chỉ ra sự có mặt của 2 nhóm hydroxy ở vị trí C-5 và C-7.
Các tín hiệu proton quan sát được tại 2,8 ppm (dd, J = 16, 6Hz, H-4) và 2,4 ppm (dd, J = 16, 6Hz, H-4); 3,9 ppm (ddd, J = 8, 8 và 5,5Hz, H-3);
4,4 ppm (d, J = 8Hz, H-2) chứng tỏ vòng C có nhóm OH ở vị trí C-3.
Thêm vào đó có các tín tại δ 6,64 ppm (dd, J = 8, 2Hz, H-6′); 6,74 ppm (d, J = 8,0Hz, H-2′) và 6,67 ppm (d, J = 8,0Hz, H-5′) đặc trưng của hệ thống spin ABX ở vòng B chỉ ra rằng vòng B có hai nhóm OH ở vị trí C- 3’ và C-4’. Số liệu phổ xem ở mục 4.5 tr.45.
Từ phân tích dữ liệu thu được, so sánh với tài liệu [41,42] xác định hợp chất AP5 là flavanol có tên gọi là 2R, 3S-2-(3,4-dihydroxyphenyl)- 3,4-dihydro-2H-chromene-3,5,7-triol hoặc catechin.
Catechin và dẫn suất của chúng là thành phần chính trong chè (chè catechin) có hoạt tính ngăn ngừa và chống ung thư, ngoài ra chúng còn có hoạt tính kháng virut herpes với tỷ số chọn lọc từ 1,5 đến 13 phụ thuộc vào chủng virut thử nghiệm [42]. Catechin còn thể hiện tính bảo vệ thần kinh chống lại glutamat, chất gây độc thần kinh ở các tế bào hippocampal HT 22 ở chuột rất hiệu quả. Chúng còn có khả năng bắt các gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) với giỏ trị IC50 là 57,6 àM…. Cỏc kết quả cho thấy catechin có thể là chất bảo vệ thần kinh do hoạt tính bắt gốc tự do của nó [43].
Catechin đã được chứng minh là có khả năng tác động đến quá trình ức chế sự tạo thành các sợi alpha S (protein alpha-synuclein) và làm mất tính bền của các sợi đó tạo ra từ trước. Sự kết tụ alpha S tạo thành sợi trong não là gia đoạn chủ chốt trong quá trình phát triển của các bệnh thần kinh thể Lewy và sự teo đa hệ thống [44]. Vì thế catechin kết hợp với một số hợp chất tự nhiên khác có thể tạo ra thuốc phòng ngừa và điều trị hai căn bệnh trên cũng như bệnh Alzheimer [45].
*) Hợp chất AP7 (quercitrin)
HO O
OH
OH
2
3
5 6 7
8 3'
6' 5'
4'
2'
1' OH
4
AP7. Quercitrin, R=Rham.
(Quercetin 3-O--L-rhamnopyranosit)
O OR
Hợp chất AP7 là chất rắn màu vàng, phân lập được từ phân đoạn 6 của cặn dịch chiết EtOAc. điểm nóng chảy 314-316oC. Các dữ kiện phổ1H-NMR, 13C-NMR được ghi ở bảng 5. Phân tích các dữ liệu phổ thu được đã nhận dạng hợp chất AP7 là hợp chất flavonol monoglycosit bởi các tín hiệu đặc trưng và dạng tín hiệu ở vùng trường thấp từ 6,2-7,3 ppm của các proton của vòng A và B trên phổ 1H-NMR; vùng tín hiệu 15C của khung flavonoit ở trường thấp (δC 90-180ppm) trên phổ 13C-NMR; đặc biệt cấu tử đường Rha được xác định dễ dàng nhờ phổ cộng hưởng từ thông qua các giá trị δ và J tại C-1 Rha và C-6- Rha. Phổ khối ESI-MS pic ion ở m/z 449 [M+H]+ là của chất AP7, kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-,13C-NMR đã xác định được công thức phân tử của chất AP7 là C21H20O11
Kết quả phân tích số liệu phổ 1H-và 13C-NMR có so sánh với tài liệu [46, 47, 48] đã xác định được cấu trúc của hợp chất AP7 là quercitrin (quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosit).
Bảng 2: Số liệu phổ 1H-NMR (500MHz, CD3OD ) và 13C-NMR (125MHz, CD3OD) của Quercitrin
Vị trí δC δH (J=Hz) Vị trí δC δH (J=Hz)
1 1′ 122,8
2 158,5 2′ 116,3 7,34 (1H, d, 2, H-2′)
3 136,20 3′ 146,3
4 179,6 4′ 149,7
5 163,1 5′ 116,9 6,90 (1H, d, 8, H-5′) 6 99,8 6,20 (1H, d, 2) 6′ 123,0 7,31 (1H, dd, 8, 2, H-6′)
7 165,8 1-rham 103,5 5,3 d (1,0)
8 91,7 6,37 (1H, d, 2) 2-rham 72,0
9 159,3 3-rham 72,1
10 105,9 4-rham 73,2
5-rham 71,9
6-rham 17,6 0,9 d (6,0)
Quercitrin có hoạt tính ức chế nitric oxít . Nitric oxít là một trong những nguyên nhân phá hủy các tế bào. Nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản chỉ ra các hợp chất phenolic có hoạt tính ức chế nitric oxít trong đó có chất quercitrin, đã ức chế nitric oxít gây ra sự kích thích các đại thực bào. Quá trình ức chế nitric oxít để làm giảm sự sản sinh NO quá mức [16].