4.4.1. Xử lý mẫu và phương pháp chiết tách:
4.5 kg mẫu cả cây (rễ, thân, lá, cành, hoa và quả) Long nha thảo
mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45oC và đem xay nhỏ. Nguyên liệu khô ở dạng bột (1,1 kg) được ngâm chiết bằng siêu âm 45 phút với dung môi EtOH ở 45oC (chiết 5 lần, mỗi lần 45 phút). Các dịch chiết được gom lại, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng kí hiệu A7. Cặn chiết tổng được chiết phân bố lần lượt với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần (diclometan, etylaxetat và cuối cùng là butanol, mỗi loại dung môi được chiết 4 lần). Gom các phần dịch chiết, cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45oC, thu được các cặn dịch chiết tương ứng: diclometan (21 g) kí hiệu A8, etylaxetat (16 g) kí hiệu A9 và cuối cùng là butanol (50 g) kí hiệu A10 (xem sơ đồ 1 mục 3.2). Các cặn phân đoạn dịch chiết được tiếp tục sử dụng để phân lập các hợp chất.
Các cặn phân đoạn dịch chiết bước đầu được chúng tôi tiến hành thử sơ bộ một số hoạt tính sinh học như: hoạt tính độc tế bào, hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính kháng sinh.
4.4.2. Phân lập các hợp chất:
Phân lập các chất trong dịch chiết CH2Cl2
Cặn dịch chiết CH2Cl2 (21 g) được tách phân đoạn bằng sắc ký cột chân không VLC (vacuum liquid chromatography), chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm, dung môi giải hấp aceton/n-hexane (0% - 100%) và MeOH/CH2Cl2 (0% - 10%) thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1 - F7).
Từ phân đoạn F3 (hệ dung môi n-hexane/aceton) thu được chất kết tủa mầu trắng. Sau khi gạn dịch và rửa, chất kết tủa này được kết tinh lại với hệ dung môi n-hexane/acetone thu được hợp chất 1 dạng tinh thể hình kim (12 mg). Phân đoạn F5 được đưa lên cột sắc ký silica gel cỡ hạt 0,015- 0,043 mm với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH(1:99-9:1) thu được chất rắn, tinh chế lại bằng hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH được hợp chất 2 (15mg). (Xem sơ đồ 2, mục 3.2)
Phân lập các chất trong dịch chiết etylaxetat
Cặn dịch chiết EtOAc (16g) được tách phân đoạn sử dụng sắc ký cột chân không VLC (vacuum liquid chromatography), chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm, dung môi giải hấp: aceton/n-hexane (0%-100%) và MeOH/CH2Cl2 (0%-40%) thu được 8 phân đoạn.
Từ phân đoạn 3 được phân tách tiếp bằng cột sephadex LH-20, dung môi rửa giải là MeOH thu được 4 phân đoạn từ F3.1-F3.4. Ở phân đoạn F3.2 thu được 1 chất rắn màu vàng, kết tinh lại bằng dung môi n- hexan/acetone thu được 20mg chất sạch dạng tinh thể (kí hiệu: AP), ở phân đoạn F3.3 cũng thu được chất rắn màu vàng, tinh chế lại bằng dung môi MeOH thu được 7mg chất sạch (kí hiệu: AP2).
Ở phân đoạn 4 tiếp tục sử dụng sắc ký cột nhanh, chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,015-0,043 mm, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2- MeOH(1:99-8:2) thu được 5 phân đoạn từ F4.1-F 4.5. Ở phân đoạn F4.2 thu được một chất rắn màu trắng, kết tinh lại bằng dung môi CH2Cl2/MeOH thu được 8 mg hợp chất kí hiệu AP3. Phân đoạn F4.3 được đưa lên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa là MeOH thu được một chất rắn, tinh chế lại trong MeOH thu được 16 mg chất sạch ở dạng tinh thể hình kim mầu vàng nhạt (kí hiệu AP4).
Từ phân đoạn 5 tiến hành chạy cột sephadex với hệ dung môi rửa MeOH/CH2Cl2 thu được 15 mg hợp chất ở dạng bột mầu nâu nhạt (kí hiệu AP5).
Ở phân đoạn 6, thu được chất rắn màu vàng, bằng sắc kí bản mỏng điều chế pha đảo RP-18, dung môi giải hấp MeOH/H2O (6/4) thu được 7mg chất sạch (kí hiệu AP7) (Xem sơ đồ 3, mục 3.2).
Phân lập cặn dịch chiết butanol
Cặn dịch chiết BuOH (50g) được đưa qua cột diaion, hệ dung môi rửa H2O/MeOH (100%, 10%, 30%, 50%, 80% và 100%) và sau cùng là
được cô lại dưới áp suất giảm đến khô kiệt, cặn thu được kiểm tra trên bản mỏng pha đảo RP-18 thấy hiện rất nhiều vệt chất rõ ràng, sẽ được tiếp tục nghiên cứu thành phần các chất tiếp theo.