2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 3 loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium) gồm: Mần tưới (E. fortunei), Yên bạch Nhật (E. japonicum), Ba dót (E. triplinerve) thông qua các mẫu tiêu bản khô được lưu trữ tại các phòng tiêu bản và các mẫu tươi thu được.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định vị trí phân loại và tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu mẫu nghiên cứu.
- Chiết và phân lập các thành phần hóa học chính của mẫu trong dịch chiết MeOH.
- Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập.
2.3. Phương pháp nghiên cứu thực vật 2.3.1. Phương pháp kế thừa tài liệu
Với đề tài luận văn này, chúng tôi tập trung thu thập tài liệu, kế thừa các nghiên cứu liên quan đến 3 loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium) trên thế giới và ở Việt Nam về các vấn đề sau:
- Vị trí phân loại và danh pháp của loài.
- Nguồn gốc và vùng phân bố của loài.
- Đặc điểm hình thái và sinh thái của loài.
- Giá trị sử dụng của loài.
- Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu.
- Thành phần hóa học của loài.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu phân loại
Phương pháp xác định tên khoa hoc là phương pháp hình thái so sánh dựa theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) để xác định tên khoa học cho 3 loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium) [11]. Đây là phương pháp truyền thống và phổ biến nhất trong nghiên cứu phân loại thực vật từ trước đến nay. Phương pháp này không đòi hỏi những thiết
bị phức tạp, dễ tiến hành, đảm bảo độ chính xác và phù hợp với điều kiện nước ta.
Khi so sánh hình thái, chúng tôi dựa trên nguyên tắc chỉ so sánh cơ quan tương ứng với nhau, đồng thời so sánh chúng trong cùng một giai đoạn phát triển. Đặc biệt, chú ý đến cơ quan sinh sản vì chúng ít biến đổi và ít phụ thuộc vào môi trường. Việc nghiên cứu và phân tích một số loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium) được tiến hành theo các bước sau:
- Thu thập mẫu vật ngoài thực địa: Các mẫu thu thập được xử lí sơ bộ để đảm bảo mẫu nguyên vẹn và bảo quản trong EtOH 70o. Trong quá trình thu hái mẫu, sử dụng máy ảnh để ghi lại hình ảnh của các loài, đồng thời ghi nhận những đặc trưng của sinh cảnh trên địa điểm thu mẫu.
- Xử lí mẫu trong phòng thí nghiệm: Đối với mẫu thu thập ngoài thực địa, phân tích chi tiết các đặc điểm mà chưa ghi nhận được ngoài thực địa, sau đó chụp ảnh bằng máy ảnh canon G10. Bên cạnh đó, mẫu tiêu bản được xử lí khô theo phương pháp làm tiêu bản khô của Nguyễn Văn Dưỡng, Trần Hợp (1971), tại phòng tiêu bản Thực vật (HNU), Bảo tàng Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [8].
- Nghiên cứu và phân tích các mẫu tiêu bản khô được lưu tại các phòng tiêu bản bao gồm: Phòng tiêu bản Thực vật (HNU), Bảo tàng Sinh học, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (HN), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng tiêu bản Khoa Tài nguyên dược liệu (NIMM), Viện Dược liệu.
- Đối chiếu các mẫu vật với mô tả gốc, các bộ Thực vật chí (của Việt Nam và các nước lân cận), các mẫu chuẩn (typus), ảnh mẫu chuẩn thu thập được và tiêu bản được lưu tại các bảo tàng để xác định tên khoa học của mẫu.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu giải phẫu
Nghiên cứu về giải phẫu lát cắt ngang thân, rễ, lá của 3 loài: Mần tưới (E.
fortunei), Yên bạch Nhật (E. japonicum), Ba dót (E. triplinerve). Tiến hành nghiên cứu giải phẫu dựa theo các phương pháp của Nguyễn Bá [1].
Nguyên liệu: thân, rễ, lá của 3 loài.
Dụng cụ, hóa chất:
- Dụng cụ: Dao cao, kim mũi mác, lam kính, lamen.
- Hóa chất: carmin phèn 0,5%, xanh methylene 0,05%, nước Javel, acid acetic 1%, nước cất.
Cách tiến hành vi phẫu
Tiến hành nhuộm mẫu:
o Cắt những lát cắt mỏng bằng dao cạo qua thân, rễ con, lá của 3 loài.
o Tẩy mẫu bằng nước Javen trong khoảng 15 – 20 phút (khi thấy tiêu bản trong suốt). Rửa mẫu lại bằng nước cất 3 – 5 lần.
o Ngâm mẫu bằng acid acetic 1% trong 5 phút. Rửa mẫu lại bằng nước cất 3 – 5 lần.
o Nhuộm mẫu bằng carmin phèn trong 25 – 30 phút. Sau đó, rửa lại bằng nước cất 3 – 5 lần, nhuộm tiếp trong xanh methylene trong 1 – 2 phút.
o Rửa lại mẫu bằng nước và ngâm vào dung dịch glycerin.
Soi mẫu:
Nhỏ dung dịch glycerin lên lam kính, đặt mẫu vào giọt glycerin, sau đó đặt lamen lên sao cho không có bọt khí. Tiến hành soi mẫu trên kính hiển vi và chụp ảnh bằng máy ảnh Optika B5 nối với kính hiển vi Zeiss Axioplanz với độ phóng đại 10X, 20X, 40X.
Cách lưu mẫu:
Để giữ mẫu cho các lần thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành ngâm mẫu trong EtOH 70o.
2.4. Các phương pháp nghiên cứu hóa học 2.4.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết
Nguyên liệu thực vật được nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần với MeOH ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH tương ứng. Phần chiết này sau đó được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclomethan, ethyl acetat cho các phần chiết tương ứng.
2.4.2. Các phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp và phân lập các hợp chất a) Phương pháp chiết hai pha lỏng
Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha dung môi hữu cơ). Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước. Phần chiết MeOH đó được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclometan cho các phần chiết tương ứng
b) Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột. Đồng thời, đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng
Bản mỏng được phun vanillin/H2SO4 đặc 1%, sau đó được hơ nóng ở 120C, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất.
c) Sắc ký cột
Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt
Một lượng silica gel ứng với cột sắc ký có đường kính và chiều cao cột thích hợp được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexan khan. Bột nhão này được loại hết bọt khí và nhồi vào cột sắc ký. Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định.
Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel
Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp.
Trộn dung dịch thu được với silica gel với tỷ lệ là 1 g chất /1,2 g đến 1,5 g silica gel.
Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel. Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silica gel.
Triển khai sắc ký cột
Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm. Cho từ từ mẫu tẩm trên silica
gel lên cột. Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang. Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích 150 ml, 50 ml và 20 ml (CC). Với cột sắc ký tinh chế (Mini-C) các phân đoạn được thu theo thể tích 3-5 ml.
Khảo sát sắc ký các phân đoạn
Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn. Sắc ký cột thường (CC) và sắc kí cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện trên silica gel Merck (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt tương ứng là 63-200 m, 40-63 m và 15-40 m.
d) Phương pháp kết tinh lại
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất và tạp chất trong dung môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau.
2.4.3. Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ
Phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử (ESI-MS)
Phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử được ghi trên thiết bị Agilent Ion Trap.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR, 125 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị theo ppm. Phổ 13C-NMR với chương trình DEPT cho biết thông tin về các loại carbon (C, CH, CH2, CH3) trong phân tử.
Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR cung cấp thông tin về các nhóm chức có mặt trong phân tử hợp chất hữu cơ. Phổ IR được đo trên thiết bị Shimadzu FT-IR Affinity-1S.