Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium L.)
3.2.1. Điều chế các phần chiết từ lá cây loài E. japonicum và E. triplinerve Nguyên liệu thực vật:
- Mẫu cây Yên bạch nhật (E. japonicum) được thu thập ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 9/2016.
- Mẫu cây Ba dót (E. triplinerve) được thu thập ở Tân Kỳ – Nghệ An vào tháng 9/2016.
Mẫu tiêu bản của 2 loài trên được lưu tại Bảo tàng Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Lá cây phơi trong bóng râm đến gần khô rồi sấy ở nhiệt độ 45℃ đến khô và được xay thành bột. Ngâm bột nguyên liệu trong MeOH ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, quy trình được lặp lại 3 lần và lọc các dịch chiết sau mỗi lần ngâm. Gộp các dịch lọc rồi cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho một phần chiết MeOH. Phần chiết này được hòa với nước rồi chiết hai pha lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan, diclometan theo độ phân cực tăng dần cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng. Cất loại dung môi các dịch chiết dưới áp suất giảm cho các phần chiết tương ứng n-hexan và diclometan. Dịch nước sau khi chiết được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết nước.
Quy trình chung điều chế các phần chiết từ các loài: Yên bạch Nhật (E.
japonicum) và Ba dót (E. triplinerve) được trình bày ở Phụ lục 14.
3.2.2. Eupatorium japonicum Thunb.
a. Phân tích TLC các phần chiết
Phần chiết n-hexan (EJLH) được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) trên bản DC-Alufolien silica gel 60 F254 (Merck) với hệ 3 dung môi CH2Cl2/aceton 3:1, 6:1, 9:1 hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4. Kết quả phân tích TLC phần chiết EJLH được trình bày tóm tắt trong Bảng 3.4.
Phần chiết diclometan (EJLD) được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) trên bản DC-Alufolien silica gel 60 F254 (Merck) với hệ dung môi CH2Cl2 và hệ 3
dung môi CH2Cl2/aceton: 90:1, 30:1. 19:1, hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4
Kết quả phân tích TLC phần chiết EJLD được trình bày tóm tắt trong Bảng 3.5.
Bảng 3.4: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EJLH) loài E. japonicum
Hệ dung môi STT Rf Dạng vệt Hiện màu
n-hexan/aceton 3:1
1 0,55 Tròn Tím hồng
2 0,39 Tròn Tím
n-hexan/aceton 6:1
1 0,45 Tròn Tím hồng
2 0,33 Dài Tím
3 0,21 Tròn Tím
4 0,18 Tròn Tím
5 0,12 Tròn Tím
n-hexan/aceton 9:1
1 0,39 Tròn Tím hồng
2 0,24 Tròn Tím
3 0,15 Tròn Tím
4 0,12 Tròn Tím
5 0,09 Tròn Tím
a. Phân tách sắc kí cột phần chiết diclometan (EJLD)
Phần chiết diclometan (EJLD) (2 g) được hoà tan trong một lượng vừa đủ diclometan và được hấp phụ trên silica gel (Merck, 200-500 μm), sau đó đưa lên cột silica gel (Merck, 63-200 μm) nhồi ướt với dung môi n-hexan.
Cột sắc kí CC được rửa giải lần lượt các hệ dung môi CH2Cl2, CH2Cl2/aceton 95:1, 35:1, 19:1 cho 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại thành 2 nhóm phân đoạn: EJLD1 (các phân đoạn 1-9) và EJLD2 (10-15).
Nhóm phân đoạn EJLD1 (1,02 g) được hòa tan trong một lượng vừa đủ diclometan và được hấp phụ trên silica gel (Merck, 63-200 μm), sau đó đưa lên cột silica gel Merck, 40-63 μm được nhồi ướt với dung môi n-hexan. Cột sắc kí CC được rửa giải lần lượt các hệ dung môi n-hexan/aceton 19:1, 15:1, 12:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1 và MeOH cho 31 phân đoạn, mỗi phân đoạn 10 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại thành các nhóm phân đoạn: EJLD1.1 (các phân đoạn 1-5),
EJLD1.2 (các phân đoạn 6-7), EJLD1.3 (các phân đoạn 8-10), EJLD1.4 (các phân đoạn 12-14), EJLD1.5 (các phân đoạn 15-21), EJLD1.6 (các phân đoạn 22-31).
Bảng 3.5: Phân tích TLC phần chiết diclometan (EJLD) loài E. japonicum
Hệ dung môi STT Rf Dạng vệt Hiện màu
CH2Cl2
1 0,90 Dài Vàng
2 0,48 Tròn Vàng
3 0,38 Tròn Hồng
4 0,29 Tròn Xanh tím
5 0,19 Tròn Vàng
6 0,13 Tròn Tím xanh
7 0,06 Tròn Tím
CH2Cl2/aceton 90:1
1 0,90 Tròn Vàng
2 0,81 Tròn Tím
3 0,61 Dài Vàng
4 0,42 Dài Hồng
5 0,29 Tròn Xanh tím
6 0,13 Tròn Tím
7 0,08 Tròn Tím xanh
8 0,05 Tròn Tím
CH2Cl2/aceton 30:1
1 0,90 Tròn Vàng
2 0,80 Tròn Vàng
3 0,58 Tròn Hồng
4 0,45 Tròn Xanh tím
5 0,23 Tròn Vàng
6 0,16 Tròn Tím xanh
7 0,11 Tròn Tím
CH2Cl2/aceton 19:1
1 0,90 Tròn Vàng
2 0,82 Dài Vàng
3 0,65 Tròn Hồng
4 0,55 Tròn Xanh tím
5 0,35 Tròn Vàng
6 0,26 Tròn Tím xanh
7 0,19 Tròn Tím
Nhóm phân đoạn EJLD2 (0,88 g) được hòa tan trong một lượng vừa đủ diclometan vừa đủ và được hấp phụ trên silica gel (Merck, 63-200 μm), sau đó đưa lên cột silica gel (Merck, 40-63 μm) được nhồi ướt với dung môi n-hexan. Cột sắc kí Mini-C được chạy lần lượt các hệ dung môi n-hexan/EtOAc 3:1, 2:1, 1:1 cho 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 10 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại:
EJLD2.1 (các phân đoạn 1-9), EJLD2.2 (các phân đoạn 10-16), EJLD2.3 (các phân đoạn 17-24), EJLD2.4 (các phân đoạn 25-40).
Hợp chất EJLD2.3 được kết tinh trong dung môi chạy cột dưới dạng tinh thể hình thoi không màu
Eupatoriopicrin (EJLD2.3)
Dạng tinh thể hình thoi không màu.
Rf = 0,2 (TLC, silica gel, n-hexan/aceton 3:1, v:v).
Vệt chất hiện màu xanh dương với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 1,48 (3H, s, CH3-14) 1,77 (3H, s br, CH3-15), 2,10 (1H, m, H-3a), 2,23 (1H, H-2a), 2,34 (3H, m, H-2b, H-3b, H-9a), 2,86 (1H, dd, J = 14,0 Hz, 5,5 Hz, H-9b), 2,94 (1H, d, J = 4,0 HzH-7), 4,37 (2H, s br, H-4’ (2H-4’), 4,46 (2H, d, J = 5,5 Hz, 2H-5’), 4,78 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-5), 4,9 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-1), 5,15 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-6), 5,59 (1H, d br, J = 3,0 Hz, H-13a), 5,82 (1H, s br, H-8), 6,29 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-13b), 6,85 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-3’).
13C-NMR (CDCl3): δ (ppm) 17,54 (CH3, C-15), 19,10 (CH3, C-14), 26,22 (CH2, C-2), 39,43 (CH2, C-3), 44,01 (CH2, C-9), 52,76 (CH, C-7), 72,5 (CH, C-8), 57,53 (CH2, C-5’), 59,32 (CH2, C-4’), 75,6 (CH, C-6), 121,24 (CH2, C-13) 127,25 (CH, C-5), 130,97 (CH, C-1), 131,94 (C, C-21), 133,95 (C, C-10), 136,58 (C, C-11), 142,59 (C, C-4), 143,89 (CH, C-3’) 165,7 (C, C-1’), 169,6 (C, C-12).
b. Phân tách sắc kí cột các phần chiết gộp n-hexan và diclometan
Các phần chiết diclometan (EJLD) và phần chiết n-hexan (EJLH) cho sắc ký đồ TLC tương tự nhau nên được gộp lại thành phần chiết gộp EJLHD (67,74 g). Phần
chiết diclometan và n-hexan (EJLHD) được hoà tan trong một lượng diclometan vừa đủ và tẩm với silica gel (Merck, 200-500 μm) sau đó đưa lên cột silica gel (Merck, 200-500 μm) ướt với dung môi n-hexan.
Cột sắc kí CC được rửa giải lần lượt với các hệ dung môi n-hexan/aceton 9:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 và MeOH cho 35 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 8 nhóm phân đoạn: EJLHD1 (các phân đoạn 1-4), EJLHD2 (các phân đoạn 5-7), EJLHD3 (các phân đoạn 8), EJLHD4 (các phân đoạn 9), EJLHD5 (các phân đoạn 10-13), EJLHD6 (các phân đoạn 14-20), EJLHD7 (các phân đoạn 21-31), EJLHD8 (các phân đoạn 32-35). Hợp chất EJLHD3.3 được kết tinh trong hệ dung môi chạy cột dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Hợp chất ELHD7 được kết tinh trong hệ dung môi chạy cột dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranosid (EJLHD7)
Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,32 (TLC, silica gel, CH2Cl2/MeOH 9:1, v:v).
Vệt chất hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (CD3OD): δH 0,66 (3H, s, 19-CH3), 0,8 (3H, s, J = 6,5 Hz, 29- CH3), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, 27-CH3), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, 26-CH3), 0,9 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 0,96 (3H, s, 18-CH3), 3,23 (1H, m), 3,3 (2H, m), 3,44 (1H, m) (H-2’, H-3’, H-4’, H-5’), 3,6 (1H, m, H-3), 3,65 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 5,0 Hz, H-6’a), 3,84 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 3,0 Hz, H-6’b), 4,41 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’), δH 5,37 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6).
β-Sitosterol (EJLHD3.3)
Tinh thể hình kim màu trắng.
Rf = 0,37 (TLC, silica gel, n-hexan/aceton 6:1, v:v).
Vệt chất hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
IR: γmax (cm-1): 3427, 290, 2866, 1649, 1458, 1381, 1049, 956.
c. Xác định cấu trúc các chất phân lập được
Eupatoriopicrin (EJLD 2.3)
Trên phổ 1H-NMR của EJLD2.3 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng tử proton của hai proton olefinic của hai liên kết đôi thế ba lần (δH 4,78, d, J = 10,0 Hz và 4,90, d br, J = 12,0 Hz) và hai nhóm methyl olefinic của các nối đôi này (δH 1,77, s và 1,48, s), một nhóm exomethylen của một vòng -lacton (δH 6,29, d, J = 3,5 Hz và 5,59, d, J = 3,0 Hz), một liên kết đôi , không no liên hợp với một nhóm carbonyl (δH 6,85, t, J = 6,0 Hz), một nhóm oxymethin liên kết với nhóm ester và bị chuyển dịch về phía trường thấp (δH 5,82, s br) và một nhóm oxymethin khác của vòng -lacton (δH 5,15, t, J = 9,0 Hz). Ngoài ra còn có mặt hai nhóm hydroxymethylen (δH 4,37, 2H, s br và 4,46, 2H, d, J = 5,5 Hz; δC 57,53 (CH2) và 59,32 (CH2)). Các độ chuyển dịch hóa học và các hằng số tương tác proton cho phép xác định một số mảnh cấu trúc của EJLD2.3.
Phổ 13C-NMR cho thấy EJLD2.3 có các tín hiệu cộng hưởng từ carbon-13 của hai nhóm methyl (CH3, δC 17,54 và 19,10) (14-CH3 và 15-CH3 của các mảnh cấu trúc A và B), 3 nhóm methylen (δC 26,22, 39,43 và 44,01), nhóm ester (C=O, δC 165,7), nối đôi thế ba lần liên hợp với nhóm carbonyl ester (C-2’, δC 130,97 và C-3’, δC
143,89) và hai nhóm hydroxymethylen (2 CH2, δC 57,53 và 59,32) (mảnh cấu trúc C), và vòng -lacton với nhóm exomethylen liên hợp với nhóm carbonyl (C-12, δC
169,6; C-11, δC 136,58 và C-13, δC 121,24), một nhóm oxymethin (CH, δC 75,6) và một nhóm methin (CH, δC 52,76) (mảnh cấu trúc D). Sự chèn hai nhóm methylen vào để liên kết các mảnh cấu trúc A, B, C và D đã dẫn đến một cấu trúc khung germacranolid.
Do đó, trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR cấu trúc của EJLD2.3 đã được xác định là eupatoriopicrin. Dạng hình học E của các nối đôi và sự định hướng không gian của H-6, H-7 và H-8 được xác định dựa trên các hằng số tương tác proton và các độ chuyển dịch hóa học carbon-13 ở các vị trí này.
Stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranosid (EJLHD7)
EJLHD7
Phổ 1H-NMR (CD3OD) của EJLHD7 cho thấy sự có mặt của 6 nhóm metyl bậc 3 ở δH 0,66 (3H, s, 19-CH3), 0,8 (3H, s, J = 6,5 Hz, 29-CH3), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, 27-CH3), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, 26-CH3), 0,9 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 0,96 (3H, s, 18-CH3), nhóm oxymethin C-3 (δH 3,6, m) liên kết với nhóm glucopyranosyl 6 nhóm oxymethin ở δH 3,23 (1H, m), 3,3 (2H, m), 3,44 (1H, m) (H-2’, H-3’, H-4’, H-5’), 3,65 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 5,0 Hz, H-6’a), 3,84 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 3,0 Hz,
H-6’a), 4,41 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’), một proton olefinic của một nối đôi thế 2 lần C22-C23 ở δH 5,37 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6). Hằng số tương tác J = 8,0 Hz của proton anomer ở δH 4,41 cho thấy cấu hình β của gốc glucopyranosyl.
Dựa trên cơ sở dữ liệu phổ 1H-NMR, EJLHD7 đã được xác định là stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranosid.
β-Sitosterol (EJLHD3.3)
Phổ IR của β-sitosterol cho các pic hấp thụ ở γmax (cm-1) 3427, 2960, 2866, 1649, 1458, 1381, 1058, 970.
Dựa trên cơ sở dữ liệu phổ IR so với tài liệu tham khảo và mẫu chuẩn, EJLHD3.3 đã được xác định là β-sitosterol.
3.2.3. Eupatorium triplinerve Vahl.
a. Phân tích TLC các phần chiết
Phần chiết n-hexan (ETLH) được phân tích bằng TLC trên bản DC-Alufolien silica gel 60 F254 (Merck) với hệ 2 dung môi CH2Cl2/aceton 49:1, 19:1, 9:1, 3:1, 1:1 hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4.
Kết quả phân tích TLC phần chiết ETLH được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.6.
Phần chiết diclometan (ETLD) được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) trên bản DC-Alufolien silica gel 60 F254 (Merck) với hệ 2 dung môi CH2Cl2/aceton:
5:1, 3:1 hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 và hệ n-hexan/EtOAc/HCOOH hiện màu bằng thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.
Kết quả phân tích phần chiết ETLD được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.7.
Bảng 3.6: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (ETLH) loài E. triplinerve
Hệ dung môi STT Rf Dạng vệt Hiện màu
n-hexan/aceton 49:1
1 0,88 Tròn Tím
2 0,7 Tròn Tím
3 0,32 Tròn Xanh
4 0,20 Dài Tím
n-hexan/aceton 19:1
1 0,92 Tròn Tím
2 0,80 Dài Tím
3 0,56 Tròn Tím
4 0,40 Dài Hồng
5 0,16 Tròn Tím
6 0,08 Tròn Tím
n-hexan/aceton 9:1
1 0,96 Tròn Tím
2 0,90 Tròn Tím hồng
3 0,80 Tròn Hồng
4 0,72 Tròn Hồng
5 0,64 Tròn Xanh
6 0,52 Tròn Hồng
7 0,44 Tròn Tím
8 0,32 Tròn Xanh
9 0,2 Dài Hồng
n-hexan/aceton 3:1
1 0,84 Tròn Tím
2 0,74 Tròn Hồng
3 0,70 Tròn Hồng
4 0,56 Tròn Hồng nhạt
5 0,44 Tròn Hồng
6 0,28 Tròn Hồng
7 0,2 Dài Xanh lá
n-hexan/aceton 1:1
1 0,96 Tròn Tím
2 0,88 Tròn Tím
3 0,56 Tròn Hồng
4 0,48 Tròn Xanh
5 0,32 Tròn Xanh
6 0,22 Tròn Xanh
7 0,12 Dài Vàng
Bảng 3.7: Phân tích phần chiết diclometan (ETLD) loài E. triplinerve Hệ dung môi Thuốc thử hiện
màu Rf Dạng vệt Hiện màu
n-hexan/aceton 3:1
vanilin/H2SO4
đặc 1%
0,16 Tròn Nâu đen
n-hexan/aceton 5:1 0,00 Tròn Nâu đen
0,32 Tròn Tím
n-hexan/EtOAc/HCOOH 10:20:1
FeCl3/EtOH
5% 0.44 Tròn Đen
b. Phân tách sắc ký các chiết
Phần chiết ETLH (17,22 g) được hoà tan trong lượng diclometan vừa đủ và tẩm với silica gel (Merck, 200-500 μm) sau đó đưa lên nhồi cột ướt (silica gel, Merck, 40-63 μm) với dung môi n-hexan.
Cột sắc kí CC được chạy lần lượt các hệ dung môi n-hexan/aceton 90:1, 49:1, 19:1, 9:1, 6:1, 1:1, 1:2 thu được 94 phân đoạn, mỗi phân đoạn 10 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại 8 nhóm phân đoạn: ETLH1 (các phân đoạn 3-30), ETLH2 (các phân đoạn 31-36), ETLH3 (các phân đoạn 37-47), ETLH4 (các phân đoạn 48-54), ETLH5 (các phân đoạn 55-63), ETLH6 (các phân đoạn 64-77), ETLH7 (các phân đoạn 78-80), ETLH8 (các phân đoạn 81-89).
Nhóm phân đoạn ETLH4 sau khi rửa aceton cho các tinh thể trắng hình kim ETLH4.2 (60 mg). Nhóm phân đoạn ETLH6 sau khi rửa aceton cho tinh thể trắng hình kim ETLH6.2 (1,058 g). Nhóm phân đoạn ETLH8 sau khi rửa diclometan cho các tinh thể hình kim màu xanh lục ETLH8.1 (20 mg).
Phần chiết diclometan (ETLD) được rửa lần lượt với các dung môi n-hexan, axeton cho tinh thể ETLD-H màu trắng ngà (45 mg).
Phần chiết ETLD, được phân tách bằng sắc kí cột CC trên pha đảo Merck RP- 18 với các hệ dung môi 70%, 90% MeOH/H2O và 100% MeOH cho 3 phân đoạn ETLD70 (882,5 mg), ETLD90 (93,1 mg) và ETLD100 (131,6 mg).
Phân đoạn ETLD70 được phân tách bằng sắc kí cột CC trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm) với hệ dung mụi gradient CH2Cl2/aceton 90:1, 49:1, 25:1, 15:1 cho 41 phân đoạn, mỗi phân đoạn gồm 7 ml được gộp thành 4 nhóm phân đoạn:
ETLD70.1 (35,7 mg), ETLD70.2 (225 mg), ETLD70.3 (45,9 mg) và ETLD70.4 (72,5 mg). Nhóm phân đoạn ETLD70.1 (35,7 mg) được kết tinh trong hệ dung môi chạy cột cho chất ETLD70.1.1 (13,5 mg).
Phần dịch rửa ETLD70.1 và ETLD70.2 được gộp lại (260,7 mg) và phân tách tiếp bằng Mini-C trờn silica gel (Merck, 15-40 àm), với hệ dung mụi gradient n- hexan/EtOAc 15:1, 12:1, 9:1 cho tinh thể ETLD70.1.2 (2 mg) màu trắng. Chất này được phân tích TLC đồng nhất với chất ETLD70.1.1
Stigmasterol (ETLH4.2)
Tinh thể hình kim màu trắng.
Rf = 0,41 (TLC, silica gel, n-hexan/aceton 4:1, v/v).
Hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,69 (3H, s, 19-CH3), 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz, 26-CH3), 0,81 (3H, t, J = 7,0 Hz, 29-CH3), 0,85 (3H, d, J = 7,0 Hz, 27-CH3), 1,01 (3H, s, 18-CH3), 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 3,53 (1H, tt, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz, H-3), 5,02 (1H, d, J = 15,5 Hz, 8,5 Hz, H-23), 5,15 (1H, d, J = 15,5 Hz, 8,5 Hz, H-22), 5,35 (1H, d br, J = 5,5 Hz, H-6).
7-Methoxycourmarin (ETLH6.2 = ETLD70.1)
Bột vô định hình không màu.
Rf = 0,45 (TLC, silica gel, CH2Cl2/MeOH 9:1, v/v).
1H-NMR (CDCl3): (ppm) 3,88 (3H, s, 7-OCH3), 6,25 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 6,82 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,84 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 7,37 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,63 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-4).
IR: max (cm-1): 3086, 3051, 3020, 1744, 1726, 1610, 1556, 1504, 1463, 1348, 1352, 1282, 1205, 1124, 1024, 979.
6,7-Methylendioxycoumarin (ETLH8.1)
Tinh thể hình kim màu xanh lục.
Rf = 0,12 (TLC, silicagel, n-hexan/EtOAc 1:1, v/v).
1H-NMR (CD3OD): (ppm) 6,11 (2H, s, -O-CH2-O-), 6,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 6,92 (1H, s), 7,05 (1H, S), 7,86 (1H, d, J = 9,5 Hz).
Esculetin (ETLD-H)
Bột vô định hình màu vàng.
Rf = 0,47 (TLC, silicagel, n-hexan/EtOAc 6:1, v/v).
1H-NMR (DMSO-d6): (ppm) 6,15 (2H, s, H-6), 6,3 (1H, d, J = 9,5 Hz, H- 3), 7,1 (1H, s, H-8), 7,22 (1H, s, H-5), 7,92 (1H, d, J = 9,5 Hz).
c. Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập
Stigmasterol (ETLH4.2)
ETLH4.2
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của ETLH4.2 cho thấy sự có mặt của 2 nhóm methyl bậc 3 ở δH 0,69 (3H, s, 19-CH3) &1,01 (3H, s, 18-CH3), một nhóm methyl bậc 2 ở δH
1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), nhóm isopropyl liên kết với C-24 ở 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz, 26-CH3) và 0,85 (3H, d, J = 7,0 Hz, 27-CH3), một nhóm methyl bậc 1 ở δH 0,81 (3H, t, J = 7,0 Hz, 29-CH3), một nhóm hydroxymethin ở δH 3,53 (1H, tt, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz, H-3), 3 proton olefinic của nối đôi ở δH 5,02 (1H, d, J = 15,5 Hz, 8,5 Hz, H-23), 5,15 (1H, d, J = 15,5 Hz, 8,5 Hz, H-22), 5,35 (1H, d br, J = 5,5 Hz, H-6).
Dựa trên cơ sở dữ liệu phổ 1H-NMR và TLC so sánh với mẫu chuẩn và tài liệu tham khảo, hợp chất ETLH4.2 đã được xác định là stigmasterol [18].
7-Methoxycourmarin (ETLH6.2 = ETLD70.1.1)
Phổ 1H-NMR cho các tín hiệu của một nhóm methoxy vòng thơm ở 3,88 (3H, s, OCH3), hai proton olefinic có cấu hình cis của một vòng lacton coumarin ở
6,25 (1H, d, J = 9,5 Hz) và 7,63 (1H, d, J = 9,5 Hz), một vòng thơm thế 1,3,4 của coumarin ở 6,82 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,84 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz), 7,37 (1H, d, J = 8,5 Hz).
Phổ IR cho các pic hấp thụ ở max (cm-1): 1741, 1726, 1610, 1556, 1504, 1463, 1398, 1352, 1282, 1232, 1205, 1124, 1024, 979.
Trên cơ sở tham khảo các tài liệu phổ NMR của coumarin các tín hiệu phổ của ETLH6.2 phù hợp với phổ của 7-methoxycourmarin đã được xác định [40].
6,7-Methylendioxycourmarin (ETLH8.1)
ETLH8.1
Phổ 1H-NMR (CD3OD) cho các tín hiệu của nhóm methylendioxy ở H 6,11 (2H, 2 proton olefinic vòng lacton của coumarin ở 6,29 (1H, d, J = 9,5 Hz), 7,86 (1H, d, J = 9,5 Hz) và 2 proton vòng thơm thế 4 lần ở 6,92(1H, s) và 7,05 (1H, s).
Trên cơ sở tham khảo các tài liệu phổ NMR của coumarin các tín hiệu phổ của ETLH8.1 phù hợp với phổ của 6,7-methylendioxycourmarin [28].
Esculetin (ETLD-H)
Phổ 1H-NMR của ETLD-H cho các tín hiệu của hai proton olefinic của một vòng lacton coumarin ở 6,30 (1H, d, J = 9,5 Hz) và 7,92 (1H, J = 9,5 Hz) và các tín hiệu của 2 proton của một vòng thơm thế bốn lần 1,2,4,5 của coumarin ở 7,10 (1H, s) và 7,22 (1H, s). Trên cơ sở tham khảo các tài liệu phổ NMR của coumarin các tín hiệu phổ của ETLD-H phù hợp với phổ của esculetin [27].
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
1. Đã xác định được đặc điểm hình thái của 3 loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium) ở Việt Nam, đồng thời bổ sung một số dẫn liệu về đặc điểm hình thái cho các loài:
- Mần tưới (E. fortunei Turcz.): lá có lông mảnh thưa, trên gờ quả có lông ngắn, núm nhụy đầu nhọn không lông, sát với vị trí xẻ thùy có lông dày đặc.
- Yên bạch nhật (E. japonicum Thunb.): mặt dưới lá có tuyến dày đặc, vỏ quả có tuyến, núm nhụy đầu nhọn không lông, sát với vị trí xẻ thùy có lông dày đặc.
- Ba dót (E. triplinerve Vahl.): thân non có lông thưa thớt, mặt dưới lá có lông nhưng rất ít, đế hoa lồi.
2. Đã xác định được đặc điểm giải phẫu của 3 loài thuộc chi Mần tưới (Eupatorium L.) ở Việt Nam:
- Về cấu trúc lá của các cây nghiên cứu có 1 – 3 lớp tế bào mô giậu, 3 – 5 lớp tế bào mô xốp, riêng loài E. japonicum có ống tiết trong mạch dẫn và có tuyến hạt ở lá.
- Về cấu trúc thân của 3 loài đều có hệ mạch dẫn phát triển và mô dày tạo thành vòng liên tục ở phần vỏ, riêng loài E. triplinerve có mô khí ở vỏ thân.
- Về cấu trúc rễ của 3 loài có sự khác biệt ở phần vỏ rễ: loài E. japonicum và E.
triplinerve đều có sợi, loài E. fortunei không có. Đặc biệt, loài E. triplinerve có mô khí dày đặc ở phần vỏ rễ thể hiện đặc điểm của các cây ưa ẩm.
3. Đã sử dụng các phương pháp sắc ký và phổ (NMR, IR) để nghiên cứu các thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Mần tưới ở Việt Nam. Nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất 𝛽-sitosterol (EJLHD3.3), β- sitosterol 3-O-β-D-glucopyranosid (EJLHD7), eupatoriopicrin (EJLD2.3) từ loài E. japonicum và 7-methoxycoumarin (ETLH6.2 = ETLD70.1.1), esculetin (ETLD-H), stigmasterol (ETLH4.2), 6,7-methylendioxycourmarin (ETLH8.1) từ loài E. triplinerve.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Bá (2007), Thực vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
2. Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh lục các loài Thực vật Việt Nam, tập 3, NXB nông nghiệp, Hà Nội.
3. Lê Kim Biên (2007), Thực vật chí Việt Nam (Họ Cúc – Asteraceae) – tập 7, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
4. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật (2004), Hà Nội.
5. Đỗ Huy Bích và các tác giả (2016), Danh lục cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
6. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1 và tập 2, NXB Y học, Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Xuân Dũng (1996), Tóm tắt luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học góp phần phân loại bằng hóa học (chemotaxonomy) một số cây thuốc và cây tinh dầu ở Việt Nam”, Đại học Tổng hợp Hà Nội, Hà Nội.
8. Nguyễn Văn Dưỡng, Trần Hợp (1971), Kỹ thuật thu hái mẫu vật làm tiêu bản cây cỏ, NXB Nông thôn, Hà Nội.
9. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, tập 3, NXB Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh.
10. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
11. Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Phương pháp nghiên cứu thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.