Chiết tách là bước đầu tiên và có vai trò lớn trong việc thu hồi và làm sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thô. Trong PPG, sản phẩm chính thu được sau quá trình tách chiết là các loại saponin, tuy vậy do bản chất của saponin là một chất có độ phân cực cao, không bền về mặt hoá học và nhiệt học, không dễ bay hơi dẫn đến những thách thức trong việc tìm ra các biện pháp hiệu quả trong quá trình tách chiết [29]. Chính vì vậy, rất nhiều các biện pháp chiết tam thất đã được thử nghiệm, cụ thể như các phương pháp chiết xuất phổ thông như ngâm, sử dụng soxhlet, chiết nóng hồi lưu cùng với các biện pháp chiết xuất hiện đại như chiết xuất sóng siêu âm, hỗ trợ vi sóng hay chiết dung môi nhanh, với các kỹ thuật có những ưu điểm và nhược điểm riêng biệt. Trong quá trình tách chiết tam thất, các bước được tiến hành lần lượt là: Quá trình tiền xử lý, chiết xuất và sau đó là tinh chế sản phẩm.
Tiền xử lý là bước đầu tiên trong quá trình tách chiết, được tiến hành với mục đích tăng hiệu quả của quá trình chiết xuất. Các bước tiền xử lý bao gồm làm khô, giảm kích thước hạt và khử chất béo. Các nguyên liệu thô từ thực vật (rễ, vỏ cây, lá, thân, củ) thường được làm khô và sau đó nghiền thành bột trước khi nhằm giảm kích thước hạt với mục đích tăng hiệu quả truyền khối của quá trình chiết. Các nguyên liệu thô thường được làm khô. Quá trình khử chất béo được tiến hành thông qua việc sử dụng dung môi ưa béo, chẳng hạn như ethyl axetat hoặc n–hexan nhằm loại bỏ chất béo khỏi hỗn hợp. Hiệu quả của quá trình phân tách được cải thiện bằng cách sử dụng một phần của cây có nồng độ saponin cao nhất [29].
Các phương pháp chiết thường được phân loại theo 2 nhóm chính: các phương pháp chiết xuất truyền thống và các phương pháp chiết xuất hiện đại. Các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể kể đến như ngâm, chiết bằng soxhlet, chiết nóng hồi lưu (HRE), với hiệu suất chiết xuất trong các phương pháp này phụ thuộc phần lớn vào khả năng tan của nguyên liệu trong dung môi. Điều này dẫn đến sự bắt buộc của việc sử dụng lượng lớn dung môi, kèm theo sự hỗ trợ về nhiệt độ (đun nóng) hoặc cơ học (khuấy và lắc). Các nhược điểm chung có thể thấy của phương pháp truyền thống là về thời gian, lượng dung môi sử dụng lớn, hiệu suất thấp và khả năng phân huỷ của các chất trong thời gian chiết [8]. So sánh với các phương pháp cũ, các phương pháp chiết xuất hiện đại được cho là tối ưu hơn, do các ưu thế như việc sử dụng ít dung môi, tốn ít thời gian hơn, có khả năng tự động hoá cũng như hiệu quả
12
hơn. Càng ngày càng có nhiều các thí nghiệm nhằm tối ưu hoá hiệu suất chiết xuất saponin trong tam thất thông qua các phương pháp chiết xuất hiện đại [29].
Việc phân lập các thành phần trong hỗn hợp chiết của tam thất có thể tốn nhiều thời gian và do sự đa dạng và phức tạp trong cấu trúc của các thành phần.
Chính vì vậy, rất nhiều kỹ thuật phân lập đã được tiến hành thử nghiệm nhằm tìm ra biện pháp phân lập và tinh chế hiệu quả nhất [32, 42]. Các biện pháp thường được sử dụng có thể kể tới là sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao [11, 21, 22, 41].
2.2.2. Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất
Tam thất thường được chiết xuất với dung môi cồn nồng độ cao, thông qua nhiều phương pháp khác nhau nhu đun hồi lưu, chiết siêu âm, chiết nóng. Những phương pháp này đều đạt được hiệu suất cao về khả năng chiết xuất saponin từ tam thất [38]. Ngoài ra, các nghiên cứu cũng chỉ ra như các yếu tố như thời gian, nồng độ ethanol sử dụng, tỉ lệ dược liệu – dung môi và số lần chiết cũng sẽ ảnh hưởng tới hiệu suất chiết của saponin [19].
Một số phương pháp cụ thể có thể tham khảo như:
Theo patent CN101513438A: PPG đầu tiên được làm sạch, khô, sau đó nghiền nhỏ và trộn với dung môi ethanol 85% với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 6 – 10. Hỗn hợp được chiết thông qua phương pháp đun hồi lưu với nhiệt độ 60oC. Sau khi đun, dịch chiết được đem đi lọc, sau đó tiếp tục chiết và lọc, tổng cộng ba lần chiết. Dịch lọc được gộp lại và cô đặc thu hồi dưới điều kiện áp suất thấp ở nhiệt độ 60oC. Dịch cô đặc được loại tạp bằng việc sử dụng vật liệu hấp phụ là nhựa macroporous D101 theo lần lượt các bước: Rửa giải trước bằng nước cất để loại tạp, sau đó rửa với ethanol 70%, thu được dịch rửa giải ethanol, cô đặc dịch, rửa giải thông qua cột alumina bằng 70% ethanol, dịch rửa giải được cô đặc đến khô để thu được saponin toàn phần. Theo thống kê, hàm lượng saponin toàn phần của phương pháp có thể đạt lên tới hơn 14% [10].
Theo patent CN104800258A về quá trình chiết xuất PPG toàn phần, tam thất được nghiền nhỏ thành bột thô sau đó cho vào bể chiết kết hợp với nước tinh khiết với tỷ lệ từ 6-8 lần, thêm chất nhũ hóa, trộn đều tới khi hỗn hợp hoà lẫn với nhau.
Hỗn hợp được chiết xuất bằng biện pháp đun hồi lưu hai lần, mỗi lần trong một giờ.
Dịch chiết được được tổng hợp lại từ hai lần, điều chỉnh pH của dung dịch từ 7 – 8 sau đó lọc và lấy dịch. Dịch lọc được tiến hành hấp phụ và sắc ký thông qua nhựa
13
macroporous, rửa giải bằng ethanol nồng độ 50 – 70% trong một hoặc hai lần. Dịch rửa giải thu được sẽ được loại bỏ ethanol bằng biện pháp ngưng tụ dưới môi trường áp suất giảm và tiến hành sấy phun để thu được dạng bột. Các ưu điểm của phương pháp được kể ra như: hiệu suất chiết tăng hơn 30% so với các phương pháp thông thường, thời gian và số lần chiết tam thất được giảm thiểu, cùng với sự tiết kiệm về giá thành cũng như tổng thời gian chiết xuất [47].
Theo patent CN101049331A, PPG được nghiền thành hạt có đường kính 3 – 8mm, sau đó thêm dung môi ethanol nồng độ 65 – 75% với tỷ lệ dược liệu/dung môi từ 10 đến 12 lần. Hỗn hợp dịch được mang đi chiết bằng phương pháp hồi lưu hai lần, mỗi lần 2 giờ. Dịch thu sẽ được hấp phụ bằng nhựa macropative D101 và rửa giải bằng nước tinh khiết với tổng thể tích khoảng từ 4 đến 6 lần thể tích cột, và sau đó được rửa với dung dịch amoniac 0,05 – 1% với thể tích khoảng 4 – 6 lần thể tích cột. Rửa cột bằng nước đến pH = 7, sau đó rửa bằng ethanol 20 – 30% với thể tích bằng 3 – 5 thể tích cột, và cuối cùng rửa giải bằng ethanol 60 – 80% với thể tích bằng
3 – 5 thể tích cột, thu được saponin toàn phần [16].
2.2.3. Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất
Đối với tuỳ loại saponin cần phân lập và tinh chế, có các phương pháp khác nhau được tiến hành như sau:
Phương pháp tinh chế notoginsenosid R1 và ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd từ củ tam thất: Đầu tiên, tam thất được chiết bằng dung môi ethanol 40 – 95%, sau đó dịch chiết được tách phân đoạn để thu được notoginsenosid R1 và ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd. Quá trình rửa giải áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao pha đảo với tỉ lệ hệ dung môi nước/ethanol biến đổi từ 30% đến 80% được sử dụng trong quá trình. Phương pháp này có một số ưu điểm như quy trình đơn giản, không gây ô nhiễm, chi phí thấp và độ tinh khiết cao (hơn 97%) [44].
Phương pháp tinh chế Ginsenosid Rg1, Re và Rb1: Chiết xuất saponin PPG toàn phần được hòa tan với ethanol, thêm dodecylbenzen natri sulfonat, sau khi hòa tan xong nạp vào nhựa hấp phụ macroporous không phân cực, với dung môi rửa giải là ethanol, cô đặc dịch rửa giải thu được. Sản phẩm khô được hòa tan với ethanol, sau đó được nạp vào sắc ký cột với quá trình rửa giải gradient dung môi là ethanol 80%
-50%, ở nhiệt độ không đổi, phát hiện ginsenosid Rg1, Re và Rb1 bằng detector UV.
Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 có độ tinh khiết hơn 90% [22].
14
Phương pháp tinh chế Ginsenosid Rg1: Chiết xuất saponin toàn phần hòa tan trong nước, tinh chế bằng cột nhựa hấp phụ macroporous không phân cực hoặc phân cực yếu, rửa sạch bằng nước, rửa giải bằng ethanol 10 % ~ 70%, thu được dịch rửa giải, cô đặc và sấy khô thu được sản phẩm thô của ginsenosid Rg1. Ginsenosid Rg1 thô, hòa tan trong ethanol, khuấy với silica gel, sau khi dung môi được làm bay hơi đến khô trên cột silica gel, rửa giải bằng dung môi hữu cơ, sấy khô dịch rửa giải.
Chất khô được hòa tan trong nước, thêm 0,1 – 5,0% than hoạt tính, khuấy, lọc để loại bỏ than hoạt tính, dịch lọc được sấy khô để thu được ginsenosid Rg1 [15].
Phương pháp tinh chế R1 và Rb1: Chiết xuất saponin tam thất toàn phần được thêm ethanol 60-90% để hòa tan, propylen glycol có nồng độ phần trăm theo thể tích 1 – 5% được thêm vào. Dung dịch thu được cho đi qua cột sắc ký (silica gel polymer đơn phân tử), rửa giải gradient bằng ethanol 80% - 50%, ở nhiệt độ không đổi, detector UV được dùng để đánh giá hàm lượng propylene glycol. Kết quả cho thấy chất rửa giải không có propylene glycol dư, sau đó cô đặc dịch rửa giải, thu được notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1 với độ tinh khiết hơn 90% [21].
15