CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R 1 , ginsenosid Rg 1 ,
Lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên các tài liệu [25, 39], điều kiện sắc ký được sử dụng được lựa chọn như sau:
- Cột sắc ký: Cột Agilent C18 (4,6ì250 mm; 3,5 àm).
- Pha động: Tiến hành trên hệ dung môi pha động gồm acetonitril (A) và nước tinh khiết (B) với các tỷ lệ khác nhau, chế độ gradient: 0 – 20 phút (20 – 25% A), 20 – 25 phút (25 – 31% A), 25 – 34 phút (31 – 34% A), 34 – 54 phút (34 – 35% A), 54 – 55 phút (35 – 20% A), 55 – 60 phút (20% A).
- Detector: UV 203 nm.
- Nhiệt độ cột: 35 ± 0,1oC.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 20 l.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử
- Tiến hành pha các dung dịch chuẩn gốc R1, Rg1 và Rb1 đều có nồng độ 320
àg/ml.
- Tiến hành pha các dãy dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 đều có nồng độ từ 10
– 160 àg/ml.
- Tiến hành pha dãy hỗn hợp chuẩn gồm R1, Rg1 và Rb1 có nồng độ 80 àg/ml.
- Mẫu thử: Cân chính xác một lượng bột tam thất mịn đã rây qua rây 180, cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung 15 ml methanol, lắc siêu âm trong 15 phút cho saponin tan hoàn toàn, bổ sung methanol tới vạch, lọc qua màng lọc 0,2 àm.
Thẩm định phương pháp
Dựa trên quy định của Dược điển Việt Nam V, AOAC và các tài liệu khác [2, 5, 6], phương pháp thẩm định và định lượng đồng thời R1, Rb1 và Rg1 được xây dựng như sau:
18
- Độ đặc hiệu của phương pháp: Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu trắng, mẫu dung dịch thử củ tam thất trong methanol vừa đủ. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện như mẫu thử. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu được không xuất hiện pic của chất phân tích, thời gian lưu của R1, Rg1 và Rb1 trong hỗn hợp dung dịch chuẩn và dung dịch thử phải tương đương nhau, tại thời
điểm tương ứng pic của R1, Rg1 và Rb1 không được xuất hiện pic lạ và phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu.
- Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 cú nồng độ 160 àg/ml. Ghi lại thời gian lưu, diện tớch pic. Yờu cầu:
Chênh lệch về thời gian lưu và diện tích pic biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% của 6 lần không được lớn hơn 2%.
- Tính tuyến tính và khoảng xác định: Tiến hành xác lập mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ R1, Rg1 và Rb1. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 cú nồng độ từ 10 – 160 àg/ml. Tiến hành sắc ký, xõy dựng phương trỡnh hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Yêu cầu: Đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị r ≥ 0,995.
- Độ lặp lại: Tiến hành định lượng 6 lần dung dịch thử củ tam thất pha trong methanol, tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng. Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối phải trong khoảng từ 0,5 – 2%.
- Độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ R1, Rg1 và Rb1 vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Thêm vào mẫu dung dịch thử củ tam thất trong methanol đã được xác định hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 một lượng chính xác chất chuẩn ở3 mức 80%, 100%, 120% so với hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu khảo sát.
Từ kết quả sắc ký sẽ tính được phần trăm tìm lại của lượng mẫu chuẩn thêm vào tính theo thực tế so với lý thuyết. Yêu cầu: Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng ≥ 1% là từ 97 – 103%. Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng ≥ 0,1% là từ 95 – 105%.
Định lượng
Áp dụng phương pháp định lượng đã được thẩm định để định lượng R1, Rg1 và Rb1 trong các mẫu bột, mẫu cao tam thất, mẫu cao tinh chế giàu saponin và xác định độ tinh khiết của các saponin điển hình là Rg1 và Rb1. Các mẫu định lượng được
19
hũa tan một lượng thớch hợp trong methanol, lọc qua màng lọc 0,2 àm, sau đú được tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện sắc ký đã được thẩm định.