CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Quy trình chiết xuất và tinh chế saponin
Quy trình chiết xuất
Trong quá trình chiết xuất, tiến hành đồng thời ba phương pháp chiết là đun hồi lưu, ngâm lạnh và chiết nóng đối với mẫu dược chất PPG nhằm khảo sát phương pháp đạt được hiệu suất chiết tối ưu. Đầu tiên, mẫu dược liệu thô tam thất được xay mịn, sau đó rây qua rây 350.
- Phương pháp ngâm lạnh: 100 gam bột dược liệu được ngâm trong ethanol
70o với tỷ lệ dược liệu/ dung môi là 1/7 và được khuấy từ trong 24 giờ. Dịch chiết sẽ được lọc và bã dược liệu sẽ tiếp tục được ngâm và khuấy trong cồn 70o với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5. Dịch chiết được lọc, gộp sau hai lần, lọc qua giấy lọc sau đó cô quay dưới áp suất giảm thu được cao lỏng 1:1.
- Phương pháp đun hồi lưu: Lấy 100 gam bột PPG và thêm vào ethanol 70o với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/7. Tiến hành đung hồi lưu hỗn hợp với nhiệt độ 70oC trong 3 tiếng. Tiến hành rút dịch chiết lần 1, lọc thu dịch và tiếp tục chiết bã dược liệu với cồn 70o với tỷ lệ 1/5. Dịch chiết được lọc, gộp sau hai lần, lọc qua giấy lọc sau đó được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao lỏng 1:1.
- Phương pháp pháp chiết nóng: Nước tinh khiết được thêm vào 100 gam bột tam thất với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/7. Hỗn hợp nước và dược liệu thu được sẽ được chiết xuất trong bình cô quay trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 50oC trong 2 giờ.
Sau đó, ta rút dịch chiết lần 1, lọc thu dịch và tiếp tục chiết bã dược liệu với nước tinh khiết với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5 trong 1,5 giờ tương tự như trên. Sau đó, dịch chiết được rút lần 2, lọc thu dịch. Gộp dịch chiết thu được trong 2 lần, lọc qua giấy lọc sau đó cô quay dịch chiết dưới áp suất giảm thu được cao lỏng 1:1.
Các mẫu thu được sẽ được pha loãng tới nồng độ phù hợp, định lượng và so sánh kết quả về hiệu suất chiết xuất so với mẫu đã được định lượng bằng methanol.
Quy trình tinh chế saponin
Quy trình tinh chế saponin toàn phần từ cao lỏng chiết xuất được bằng nhựa macroporous D101 thông qua phương pháp sắc ký cột
20
- Chuẩn bị cột: Ngâm nhựa microporous D101 trong ethanol 96o trong 12 giờ, rửa sạch lại bằng nước, rút kiệt nước đến khô. Sau đó 300 gam nhựa được nạp lên cột với thể tích khối nhựa là 500 ml.
- Quá trình hấp phụ: Hoà tan 50 gam cao lỏng 1:1 trong nước với tỷ lệ khối
lượng là 1/10, sau đó dung dịch cao – nước được hấp phụ lên cột chứa nhựa macroporous D101 với tốc độ 10 ml/phút. Đồng thời mở khóa rửa giải cột với cùng tốc độ 10 ml/phút.
- Quá trình giải hấp phụ: Sau khi toàn bộ saponin trong dịch chiết đã được hấp phụ, tiến hành rửa cột bằng 2500 ml nước tinh khiết với tốc độ 30 ml/phút. Sau đó rửa giải cột bằng 2500 ml ethanol 70% với tốc độ 20 ml/phút. Loại bỏ dịch nước.
Dịch rửa giải ethanol 70% được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để loại dung môi, sau đó dung môi được loại bỏ hoàn toàn bằng phương pháp đông khô ở nhiệt độ -85oC và áp suất khoảng 10 Pa, thu được cao tinh chế giàu saponin.
Tinh chế saponin điển hình
Cân chính xác khoảng 250 mg cao tinh chế giàu saponin, sau đó hòa tan trong ethanol 70% thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 50 mg/ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,2 àm. Sử dụng dịch lọc thu được, tiến hành tinh chế saponin điển hình bằng phương pháp sắc ký lỏng điều chế đầu dò PDA, với điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: Cột Agilent 10 Prep-C18 250 x 21,2 mm; 10 àm.
- Pha động: gồm acetonitril (A) và nước tinh khiết (B) với các tỷ lệ khác nhau,
chế độ gradient: 0 – 20 phút (20 – 25% A), 20 – 25 phút (25 – 32% A), 25 – 34 phút (32 – 34% A), 34 – 45 phút (34 – 35% A), 45 – 50 phút (35 – 20%
A).
- Detector phát hiện: UV 203 nm.
- Nhiệt độ cột: 35 ± 0,1 oC.
- Tốc độ dòng: 20 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 500 l.
21
Dưới sự phát hiện của detector UV 203 nm, từng các phân đoạn dịch chứa các saponin điển hình được thu hồi. Ly tâm dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40oC để loại dung môi hữu cơ, sau đó dịch được đông khô ở -85oC và áp suất khoảng 10 Pa, để thu được các saponin điển hình tinh chế.