CHƯƠNG 2 ĐỎI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.2. PIIƯƠNG PHẤP NGHIÊN CƯU
Nghiên cứu mô tả hồi cửu: hồi cữu bộnh an thu thập đặc điểm làm sàt^.
huyết học vã đặc điếm đột biến gen NPM1 -mutA, FLT3-ITD vã FLT3-TKD.
2.22. NỘI đung và biển số nghirn cửu
Nghiên cứu đặc diêm dột biến gen NPMl-mutA. FLT3-ITD vã FLT3- TKD ở bệnh nhân LXMc dòng tuy.
Nghiên cứu đặc diêm lảm sảng, huyết học cua bệnh nhân LXMc có đột biền gen NPMl-mutA. FLT3-ITD vã FLT3-TKD:
+ Đặc diêm lâm sàng: thiếu mãu. xuầt huyót, gan. lách, hạch to.
+ Dặc diêm tể bào mãu ngoại si và túy xương: Hb. SLHC, SLBC, SLTC. tỷ lệ blast mâu. SLTBTX. lý lệ blast tuy.
•W.- zTiCe: <€ 4ằ HỄ?
2.23. Tiru chuan chan đoán I.XMc dòng tuy
- Chần đoán LXMc: thco lieu chuân cua WHO 2008
+ Lam sàng; bệnh nhân cõ các hội chứng thiếu mâu. xuất huyết, nhiêm trùng va thâm nhiễm.
+ Xét nghiệm: bệnh nhàn cỏ tý lệ blast > 20% tế bão có nhãn trong tuy xương.
- Chần đoản LXMc dòng tủy: nhuộm hóa học te bào có PAS ảm Tinh.
NÍPO vả sudan đen dương lính, các CD dòng túy (CD13. 14. 33, 34. 117) dương lính, các CD dòng lytnpho (CD3.7. 10. 19. 20) ảm tinh.
2.2.4. Các kỹ thuật sư dụng trong nghiên cứu 2.2.4.1. Kỷ thuật Huyết túy dồ và hóa học te bào
Tiến hành theo quy trinh tieu chuẩn cua kltoa Te bào tô chức học Viện Huyết học Truyền máu Trung ưưng.
2.2.4.2. Kỳ thuật PCR xác dịnh triển dốl gen NPMl-inutA, FLr3-ỉrD rỏ FLT3-TKD:
Tien hanh theo quy trình chuẩn cua khoa Di truyền và Sinh học phân tư Viện Huyết học - Truyền rnảu Trung ương như sau:
• rách AR.\ theo kit OMEGA - Chuân bị với hộp kit mới:
4 Thêm 450ml DEFC Water vảo chai ERL Buffer
4 Thêm 200ml Ethanol (100%) vào chai RNA Wash Buffer 2 4 Thèm óOpl 2-mercaptoethanol vào 30ml NTL Lysis Buffer 4 Chuãn bi khay đá
♦ Bật mây ly tâm 4°c
•w.- .ZtiW <€
+ Cho ồng DEFC Water (1.5 ,)ml vảo mây heat 70°C - Tiến hành:
STT Các buức tỉén hành
1 Rà đỏng bạch câu dà lysis trong NTL Lysis Buffer 2
Chèn cột Homogenizer Cỡlumm vào ồng 1.5 ml. ghi mà BN trên nằp cột vã óng 1.5ml. Chuyên dịch sang cột Homogenizer Columm
3 Ly tàm 13000 rpm'2phút
4 Giữ lụi dịch qua cột. loại bơ cột
5 Thêm 500 ụl Ethanol 70%. invert đều
- Neu có tua tụo thành sè lãn gitỉỉH hiệu suùĩ thu -4K.V 6 Chén cột Hibind RNA mini columni vào ồng 2 ml. glu mă BN 7 Chuyên 500 ụl d|ch len cột Hibind RNA Mini Column!
8 Ly tâm 13000 rpm'2phut. Loụi bơ dịch qua cột 9 Chuyên het dịch côn lại lên cột
10 Ly tàm 13000 rpm’2phút. Loại bơ dịch qua cột 11 Thêm 600 ul RWF Wash Buffer
12 Ly tâm 13000 rpm/2phút. Chuyên cột sang ồng 2 ml mời 13 Thêm 500 pl RNA Wash Buffer 2
14 Ly tâm 13000 rpm'2phủt. Loại bo dich qua cột 15 Láp lai bước 19-20 một lán nửa
16 Chuyên cột sang ông 2 ml mới. ly tàm 13000 rpm2phũt.
Chuyền cột sang ổng 1.5 ml
17 Bô sung 50 pl DEFC Water vào chính giữa màng lọc. Ư 5 phút ở nhiệt độ phòng
18 Ly tâm 130ÕÕ rpm'2phũt
•W.- .-Tớ ca: <€ 4ằ HỄ?
19 Bão quan ARN ờ -70°C
• ỉ)o kiểm tra chut lưựiiỊỊ AR.\ trên /náy ílt> quang phô nanodrop
• rống hựp cDNA bẵng kít ÌII.O-Invỉtrơge/1 Thành phẩn hoa chất, sinh phàm:
4 5X VILO Reaction Mix: 4.0 ul + 10X Superscript Enzyme Mix: 2.0 pl
+ ARN: I pg
+ H.'O them váo đen du: 20 pl Chu trinh nhiệt: 25®c 10’ 42°c 60' X5°c 5’
* Chạy phàn ứng PCX
- Chạy RT-PCR gen NPMl-mutA:
♦ Thánh phần hóa chắt, sinh phàm:
IX PCR supper mix: 22.5 pl NPMl-mutA-RT-F3 lOpM: 1.0 pl NPMl-mutA-RT-Rl lOpM: 1.0 pl
Sân phàm cDNA: 1.0 pl
+ Chu trinh nhiệt:
95°c 4’ |95°c 30" 64PC 45" 72°c 30'U 72°c I ị 15<c forever Chạy RT-PCR gen FLT3-ITD
+ Thành phần hỏa chat, sinh phẩm:
H:O: 8.5pl
2X Fidely Taq PCR: 12.5pl
FLT3-RT-F1 lOpM: l.Opl
FLT3-RT-R1 lOpM: l.Op]
Sân phâm cDNA: 2.0pl
•W.- .-Tớ ca: <€ 4ằ HỄ?
+ Chu trinh nhi Ct:
95°C4’ |95°c 30" 47°C45” 68°c I’U 68°c I’Ị 15°C forever - Chạy PCR-RFLP EcoRV gen FLT3-TKA
+ Thành phần hỏa chất, sinh phàm
H;O: s.5pl
2X Fidely TaqPCR: 12.5|d FLT3-RT-F3 lOpM: l.Opl FLT3-RT-R3 lOpM: l.Opl
Sán phâni cDNA: 2.0pl
+ Chu trinh nhiệt:
95°c 4- 95°c 30- 64 c 45" 72°c 30"U 7M' I • 15:c foiwer + cẳt san phàm PCR với EcoR V:
H;O: 12.0pl
10X Buffer H: 2.0 pl
Enzyme EcoRV: 1.0 ụl
SánphâmPCR: 5.0 pl
Ũ 37°c qua đêm
• A7ôn tra kểt quà PCX bang diện ưi trên gel agarose - ChuãnbỊ gel agarose
1 Lựa chọn nồng độ agarose thích hợp cho sán ph;ìm ADN,
+ Cân lượng agarose phủ hợp. cho vào binh cách th uy củng với độm 100 ml TBE0.ÍX.
+ Dun sôi hon hợp bảng lõ vi sõng, lie đều cho agarose lan het.
+ Dê nguội tự nhiên hoặc trong bê ôn iứũột xuống 65CC.
♦ Thêm 5 pl hoa chất nhuộm ADN’ (Redsíđe 20000X). úc nhc dè hoa tan.
+ Dô từ lữ dung dịch agarose lên khuôn đúc gel trành lụo bọt khi.
♦ De gel nguội tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoang 3O'-45*.
•W.- .-Tí ca: <€ 4* HỄ?
+ Gel agarose sau khi làm nguội, có the dược su dụng đế điện di hoặc gỏi kín trong nylon và báo quân 2-8°C qua đêm.
- Tiến hành
♦ Dột khay gel xáo bè diện di theo chiêu từ diện cực ám dương.
Nụp dung dịch TBE 0.5X vào bê diện (li cho dến khi bao phu hoàn toàn bề một gel khoang 0.5 cm.
♦ Chia 10 15 ui mẫu ADX vảo khay mau theo thứ tự. thêm lượng loading dye (6X)phù hợp. trộn đều bàng pipet.
+ Tùy theo phô kích ihưỏc san phám điện di. nạp 5 7 pl thang chuân ADN vào 2 giềng ngoài cùng hoặc ớ giữa các mẫu.
+ Nạp từ từ hỏn hợp mẫu loading dye vào giêng.
+ Diện di ưong khoảng 40’ 60*. Đổi với sàn phẩm có kích thước trên dưới 2kb. diện trở phu hợp lã 5 - 8 vol 'em chiều dái gel.
+ Soi gel trài kinh ƯV va chụp anh két qua.
*Rlỷn luận Ịìltãiỉ tích kết qua
- Yêu câu: chúng H;O không được xuất hiộn bâng bầt kỳ. chúng người không được xuầt hiện bảng trùng lcích thước dột biền, chửng đương chi lên bâng đúng kích thước.
Mau xuât hiện báng có kích thước trưng với đột biến nào thi bệnh nhân mang đột biên tương úng.
- Đột biển gen NPMl-mutA dương tính có kích thước bâng san phàm 320 bp Mầu ám tính sỏ không xuẩt hiện san phâm PCR.
•W.- <€ 4* HỄ?
H20 NC ♦ M 171 175 182
NPM1 - 24.2.2014
Hĩnh 2.1: Kef qua điện dỉtrên gd cua gen NP.yfl
Bing đột biển gen FLT3-ITD dương lính có kích thước trong khoíing 148 bp 364 bp. hàng nội kiểm 133 bp.
— > ITD
H2O NC + 885 891 M
FLT3-ITD
Hình 2.2: Kct qua ííiịn di trẽn gd cua gen FLT3-1TD - Dột bicn FLT3-1 KD dương lính khi:
Bảng sán phẩm Enzyme cảt EcoRV Bảng sân phẩm PCR
Wild type 3 OS bp vả 172 bp 480 bp
FLT3-TKD 480 bp 480 bp
921 929 930 NC +TKD NC M 921 929 930 932 +TKD NC sp PCR <-'* -> CAT ENZYM
TKD-17,3.15