CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chiết dịch nghiên cứu
Cây Sài đất sau khi được thu hái tại thành phố Đà Nẵng, được rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khô, xay nhỏ làm nguyên liệu cho quá trình thu chiết cao.
Cây Sài đất được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt bằng ethanol. Dịch chiết sau khi ngấm kiệt được thu hồi dung môi bằng cô quay chân không với nhiệt độ 55ºC, áp suất 137atm để tạo cao chiết.
2.3.2. Phương pháp khảo sát sơ bộ các thành phần trong cao chiết
Khảo sát sơ bộ các thành phần hóa học được áp dụng phương pháp của trường đại học Dược khoa Rumani có cải tiến phù hợp với phòng thí nghiệm (Bộ y tế, 2006). Nguyên tắt của phương pháp là dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách các hợp chất bằng dung môi có độ phân cực khác nhau. Sau đó, xác định các hợp chất này bằng các phản ứng chuyên biệt [4].
Định tính alcaloid [43]:
19 Cân 2g mẫu cao cho vào 20ml dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 50%.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính.
Định tính saponin [43]:
Quan sát hiện tượng tạo bọt: lấy 1ml dịch chiết thêm vào khoảng 5ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
Định tính coumarin [43]:
Phản ứng mở đóng vòng lacton: cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết; ống 1: thêm 0,5ml NaOH 10%; ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng: ống 1: có tủa đục màu vàng; ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4ml, nếu thấy ống 1: trong suốt và ống 2: có tủa đục, thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính.
Định tính tannin
Lấy 2g cao hòa tan trong 10ml dung dịch cồn 50% rồi chia làm 2 phần bằng nhau:
- Thử nghiệm FeCl3: nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc của mẫu chuyển sang màu xanh lam hoặc màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tại tannin [17].
20 - Thử nghiệm chì acetate: nhỏ 3 giọt dung dịch chì acetate vào phần thứ ba, lắc đều cho đến khi thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt thì chứng tỏ có sự tồn tại của tannin trong mẫu cao [43].
Định tính flavonoids [43]
Cân 2 g mẫu cao hòa tan trong 10ml nước cất rồi hút 3ml hỗn hợp vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với FeCl3.
- Thử nghiệm NaOH 10%: thêm 2ml dung dịch NaOH 10% vào 3ml hỗn hợp rồi lắc đều. Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của ílavonoids trong mẫu cao.
- Thử nghiệm FeCl3: nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 5% vào 3ml hỗn hợp rồi lắc đều. Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại flavonoids trong mẫu cao.
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Cao chiết ethanol từ cây Sài đất được pha trong dung dịch DMSO vô trùng với nồng độ 200mg/ml, kháng sinh được sử dụng là ampicilin (1mg/ml pha trong DMSO) và chứng âm là dung dịch DMSO vô trùng.
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000).
Theo đó, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo đường kính vòng ức chế vi sinh vật (DK) theo công thức
DK (mm) = D - d Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn
d là đường kính giếng thạch.
Kháng sinh ở trong giếng thạch sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
21 được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giếng thạch.
Cách tiến hành:
Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch bằng cách đục giếng thạch. Cho vào mỗi đĩa Petri 25ml môi trường LB vô trùng cấy có cấy trang vi khuẩn. Mỗi đĩa Petri được đục 3 giếng thạch, trong đó gồm:
- 1 giếng chứa 0.2ml cao chiết ethanol từ cây Sài đất.
- 1 giếng chứng âm chứa 0.2ml dung dịch DMSO 5% vô trùng.
- 1 giếng chứng dương là kháng sinh
Được tiến hành lặp lại 3 lần. Các đĩa được ủ ở 370C trong vòng 16 - 20 giờ. Đường kính vùng ức chế được đo bằng thước đo đơn vị mm [18].
2.3.4. Phương pháp thử độc tính cấp
Xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành [19, 20]. Cụ thể là cao chiết được pha ở nồng độ gốc 20gram/ml (có thể đạt được do mẫu cao chiết) nhằm khảo sát độc tính cấp. 30 chuột chia thành 5 nhóm (6 con chuột/nhóm) gồm 1 nhóm đối chứng sinh lí, 4 nhóm thí nghiệm và bị bỏ đói hoàn toàn 16h trước khi cho uống mẫu. Mẫu được cho uống với liều cao nhất có thể và giảm dần, cụ thể là 1000; 500; 250 và 125mg/kg thể trọng. Sau khi cho uống cao chiết ethanol từ cây Sài đất với một liều duy nhất từ 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50.
Xác định LD50 được tiến hành theo phương pháp của Karber như sau:
LD50 = LD - Σab/n.
Trong đó: LD50 là liều chết 50% động vật thí nghiệm;
LD là liều gây chết 100% động vật thí nghiệm;
22 n là số động vật trong một nhóm;
a là sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp;
b là tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp. Đồng thời, chuột chết sẽ được mổ để xét nghiệm đại thể.
2.3.5. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của cao chiết ethanol từ cây Sài đất
* Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao chiết ethanol từ cây Sài đất trên mô hình gây phù chân thực nghiệm bằng carragenan
Chuột nhắt trắng chia thành 5 lô. Mỗi lô 6 con
- Lô 1 (lô thử nghiệm): uống cao chiết liều 500mg/kgP - Lô 2 (lô thử nghiệm): uống cao chiết liều 250mg/kgP - Lô 3 (lô thử nghiệm): uống cao chiết liều 125mg/kgP
- Lô 4 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10mg/kg P - Lô 5 lô uống nước nước cất
Chuột được uống thuốc hai lần, lần thứ nhất trước khi gây viêm một ngày, lần thứ hai trước khi gây viêm một giờ. Tiến hành gây viêm bằng cách tiêm 0,1ml caragenan1% (pha trong nước muối sinh lý) vào gan bàn chân sau, bên phải chuột. Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) vào các thời điểm:
trước khi gây viêm, sau khi gây viêm 2h, 4h, 6h, 24h.
Kết quả thu được được tính toán theo công thức của Fontaine Độ tăng thể tích chân chuột được tính theo công thức:
V (%)= [(Vt – V0)/V0]x100 Trong đó:
V0: thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt: thể tích chân chuột sau khi gây viêm
V: độ tăng thể tích chân chuột
23 Tác dụng chống viêm cấp của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù
I%= [(Vc% - Vt%)]/ Vc%]x100 Trong đó:
Vc%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng (%)
Vt%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột lô thử (%)
* Nghiên cứu tác dụng kháng viêm bằng mô hình gây u hạt
Mô hình u hạt bông đã nghiên cứu giai đoạn tăng sinh của viêm. Chiết xuất ở các liều khác nhau (125; 250 và 500mg/kgP) và indomethacin ở mức 10 mg/kgP được trao cho động vật bằng miệng.
Chuột được chia thành 5 lô, mỗi lô 6 con
- Lô 1 (lô thử nghiệm): uống cao chiết liều 500mg/kgP - Lô 2 (lô thử nghiệm): uống cao chiết liều 250mg/kgP - Lô 3 (lô thử nghiệm): uống cao chiết liều 125mg/kgP
- Lô 4 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10mg/kgP - Lô 5 lô uống nước cất
Sau 30 phút các con vật đã được gây mê. Và sau khi cạo lông, 10mg bông viên vô trùng đã được đưa vào, mỗi viên một nách (nách phải).
Cho uống thuốc liên tục trong 7 ngày, ngày thứ 8 mỗ lấy viên bông vô trùng. Các viên được ủ ở 37°C trong 24 giờ và sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi.
Sự tăng trọng lượng khô của các viên được lấy làm thước đo sự hình thành u hạt.
2.3.6. Phương pháp xác định công thức bạch cầu Phương pháp xác định công thức bạch cầu
24 Công thức bạch cầu được xác định theo phương pháp Ludrasepa và Kudrasep: máu được phết lên tiêu bản, nhuộm giêmsa, đếm bạch cầu trên kính hiển vi phóng đại 1000 lần, đếm 200 bạch cầu liên tiếp nhau ở 4 góc và 2 đầu tiêu bản theo nguyên tắc hình chữ chi. Mỗi mẫu máu đếm 5 lần rồi lấy trung bình chung.
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsoft excel. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng (M ± SD) & (M ± SE). Đánh giá, so sánh giá trị trung bình giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t-Student.
2.3.8. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Thu thập thông tin khoa học trên cơ sở nghiên cứu các văn bản, tài liệu đã có và bằng các thao tác tư duy logic để rút ra kết luận khoa học cần thiết.
25