Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Thu thập số liệu nghiên cứu
2.3.4. Quy trình kỹ thuật xét nghiệm xác định mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng (Halosperm) theo thường quy của của trung tâm di truyền và gen Đại học Y Hà Nội
Nguyên lý xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng: dựa trên phương pháp đánh giá sự phân tán chất nhiễm sắc.
Người thực hiện: Nhân lực trực tiếp: Bác sỹ Di truyền, Cán bộ xét nghiệm (kỹ thuật viên/cử nhân xét nghiệm) đã được đào tạo và có chứng chỉ hành nghề hoặc chứng nhận về chuyên ngành di truyền hoặc xét nghiệm; Số lượng: 02
Vật tƣ:
+ Hoá chất sinh phẩm : Halosperm test, Thuốc nhuộm giêmsa, Cồn 70%, 90% và 100%
+ Đầu côn 100 ul và 1000 ul
+ Pipet nhựa
+ Ống eppendorf 1,5 ml, ống eppendorf 0,2ml
+ Lam kính
+ Khẩu trang
+ Găng tay vô trùng
+ Găng tay xử lý dụng cụ, quần áo bảo hộ, dung dịch nước rửa tay, cồn sát khuẩn tay nhanh, dung dịch khử trùng, khăn lau tay.
+ Giấy thấm, giấy xét nghiệm, sổ lưu kết quả xét nghiệm, bút viết kính, bút bi.
Trang thiết bị:
+ Kính hiển vi quang học
+ Máy đếm tế bào
+ Bộ máy tính và máy in
+ Tủ lạnh thường
+ Tủ âm sâu -200C
+ Bình cách thủy
Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chuẩn bị người bệnh: người bệnh được giải thích về việc lấy mẫu bệnh phẩm, hướng dẫn người bệnh phối hợp để lấy mẫu theo đúng yêu cầu.
- Loại mẫu bệnh phẩm: tinh dịch.
- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản : lọ nhựa vô khuẩn.
- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: điều kiện nhiệt độ phòng, nếu chưa thực hiện ngay trong vòng 2 giờ, mẫu cần được bảo quản tủ lạnh -4 0C trong vòng 24 giờ.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng…): tinh dịch được lấy vào lọ đựng tinh dịch bằng phương pháp thủ dâm sau 2 – 7 ngày không xuất tinh.
Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
Thời gian thực hiện kỹ thuật (ước tính, đơn vị là giờ): 5 giờ
Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm di truyền sinh học phân tử.
Các bước tiến hành
- Bước 1: Pha loãng mẫu tinh dịch bằng PBS 1x: 5 - 10 triệu/ml.
- Bước 2: Cho 25àl mẫu tinh dịch đó pha loóng vào tube chứa Agarose
37oC. Trộn đều bằng pipette.
- Bước 3: Nhỏ 1 giọt (10 - 15àl) hỗn hợp tinh dịch trờn lờn lam kớnh (nhỏ trên 2 giếng, mỗi giếng 1 giọt). Đậy lá kính lên (tránh bọt khí).
- Bước 4: Đặt tiêu bản vào ngăn mát tủ lạnh/5 phút: đến khi thạch đông.
- Bước 5: Lấy tiêu bản từ trong tủ lạnh ra, cẩn thận gỡ phiến kính. Để ở nhiệt độ phòng với vị trí tiêu bản nằm ngang cho đến khi khô hoàn toàn.
- Bước 6: Đặt tiêu bản vào khay chứa dung dịch biến tính, ngâm trong 7 phút ở nhiệt độ 22º C (nhiệt độ phòng). Dùng nhíp di chuyển tiêu bản cho thấm đều dung dịch biến tính.
- Bước 7: Chuyển tiêu bản sang khay chứa 10 ml dung dịch ly giải, ngâm
25 phút.
- Bước 8: Chuyển tiêu bản sang khay chứa nước cất để rửa dung dịch ly giải. Để yên trong nước cất 5 phút.
- Bước 9: Chuyển tiêu bản lần lượt sang các khay chứa ethanol 70% (2 phút), ethanol 90% (2 phút), ethanol 100% (2 phút).
- Bước 10: Lấy tiêu bản khỏi khay và để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng.
- Nhuộm: Giemsa 10% trong 7 - 10 phút.
Nhận đinh kết quả
o Xem xét kết quả QC (có thể chạy QC trước hoặc QC song song tùy thuộc loại xét nghiệm): Sử dụng mẫu tinh dịch và thực hiện chứng âm và chứng dương. Chứng âm là chứng mà khi tất cả vi trường không hiển thị quầng sáng halo. Chứng dương là chứng khi tất cả tinh trùng trong các vi trường đều có quầng halo.
o Đọc kết quả và nhận định kết quả: Cần quan sát tối thiểu 500 tinh trùng dưới kính hiển vi quang học với các thông số sau:
Tinh trùng không bị phân mảnh DNA:
Tinh trùng với “Halo” rộng - “Halo” halo lớn hơn hoặc bằng kích thước nhân.
Tinh trùng với “Halo” trung bình: kích thước halo trung bình.
Tinh trùng bị phân mảnh DNA:
Tinh trùng với “Halo” nhỏ -“Halo” bằng 1/3 hoặc bé hơn 1/3 kích thước nhân.
Tinh trùng không có “Halo”.
Tinh trùng không có “Halo” và thoái hóa- có nghĩa là không xuất hiện
“Halo”, đồng thời nhân có hình dạng không bình thường và bắt màu thuốc nhuộm yếu.
Sau khi quan sát lam kính dưới kính hiển vi quang học và đếm ít nhất
500 tinh trùng có đuôi trong tinh dịch để xác định phân mảnh DNA tinh trùng. Xác định bằng quầng halo của tinh trùng theo Fernandez 2003 (hình 1). Độ đứt gãy DNA tinh trùng được tính theo công thức sau:
Hình 2.3. Hình ảnh tinh trùng có quần halo và không có quầng halo
(1) Tinh trùng có quầng halo lớn (Big halo): Kích thước quầng halo ≥ đường kính ngang của nhân.
(2) Tinh trùng có quầng halo vừa (Medium halo): 1/3 đường kính ngang của nhân < kích thước quầng halo < đường kính ngang của nhân.
(3) Tinh trùng có quầng halo nhỏ (Small halo): Kích thước quầng halo ≤ 1/3 đường kính ngang của nhân.
(4) Tinh trùng không có quầng halo (Without halo).
(5) Tinh trùng thoái hóa (Degraded): Tinh trùng có nhân bắt màu kém, không đều.81
Đánh giá
- DFI < 15% là tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng thấp.
- DFI: 15 - 30%: tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng trung bình.
- DFI > 30%: tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng cao