2.1.1. Hóa chất& thiết bị a/ Hóa chất:
b/ Thiết bị
Zn (CH3COO)2.2H20 (độ tinh khiết 99%, xuất xứ Trung Quốc) NaOH ( độ tinh khiết 96%, xuất xứ Trung Quốc)
Nước Ethanol
tủ say 200°C Bép dién Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0001g Nhiệt kế
Autocalve
Thiét bi do SEM
XRD
May ly tam
Becher, ống nhỏ giọt va các dung cụ thủy tinh thông thường
khác trong phòng thí nghiệm
2.1.2. Các phương pháp phân tích vật liệu +% Phân tích XRD:
Dùng phương pháp XRD xác định cấu trúc và khảo sát độ đơn pha của vật liệu tong hop. Phương pháp XRD cho phép xác định chính xác sự tồn tại của kim
loại đó trong vật liệu dựa trên các peak thu được so với các peak chuân của oxit kim
loại. Mẫu XRD được đo ở 20 = 10-80, với bước nhảy 0,02.
+% Phân tích SEM:
Nhăm kiểm tra hình thái và kích thước của vật liệu tong hop voi cac diéu kiện khác nhau về pH, nhiệt độ phản ứng, thời gian phan ứng. Mẫu được nghiền
nhỏ với bi trước khi do SEM.
% Phân tích kích thước hạt:
Kích thước hat được phân tích từ hình SEM sử dụng phần mềm Imagel.
Nham đưa ra biểu đồ phân bố kích thước hạt, từ đó biết được kích thước hạt của vật liệu tong hợp.
Cách đo kích thước hạt từ hình SEM sử dụng phần mềm Image] như sau:
- Vào File > open— Chọn file hình cần đo
- Vẽ một đường thăng dài bằng thanh kích thước trên hình SEM rồi vào Analyze— set scale chon “unit of length” là “nm”. Bước nay nhằm kiểm định hình anh, cho thay mối tương quan giữa đơn vi pixels với don vị nanomet.
- Vào Analyze—> chọn Measure—> vẽ đường thăng tương ứng với kích thước hạt
của từng hạt. Chọn vẽ khoảng 50 hạt trên hình SEM.
- Số liệu kích thước hạt thu được lưu vào file Excel. Sau đó vẽ biểu đô phân bố kích thước hạt trên phần mềm OriginPro 8.5.1.
2.1.3. Quy trình tổng hợp vật liệu nano ZnO
Có nhiều phương pháp khác nhau để tổng hợp nano ZnO, nhưng phương pháp dung nhiệt có nhiều ưu điểm như kiểm soát hình thái dé dàng hon, tính đồng nhất tốt hơn, xử lý ở nhiệt độ thấp, giảm kích thước hạt, chế tạo dễ dàng hơn ở quy mô lớn, khả năng sử dụng vật liệu có độ tinh khiết cao, tong hop được vat liệu nano có hình thái và kích thước khác nhau. Vì thế, trong nghiên cứu nay, nano ZnO được điều chế bằng phương pháp dung nhiệt.
1.0975ứ Zn (CH:COO)z.2HzO 50ml nước cắt
Ỷ Điều chỉnh pH 8-10
A . % 600
hut lŠ
Khuây dung dich ở 60°C trong 30 phút bằng NaOH 0.2M:
Vv `Điêu kiện (100- Phản ứng trong autoclave |
170°C; 6- 12h)
A Á
Làm nguội
A Á
Ly tâm, rửa tủa với Co2HsOH,
Sản phẩm
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp vật liệu nano ZnO bằng phương pháp dung nhiệt Quy trình tổng hợp:
Lay một lượng Zn (CH3COO)2.2H20 vào becher 250ml hòa tan trong 50ml dung môi nước khuấy mạnh ở 60° C thu được dung dịch Zn”' 0,1M. Điều chỉnh pH trong khoảng từ 8-10 bằng dung dịch NaOH 0,2M. Không khảo sát ở pH lớn hơn vì nếu môi trường kiềm quá mạnh có thé sẽ sinh ra các sản phẩm phụ như Zn(OH)a, Zn(OH)}⁄47. Sau khi khuấy dung dịch ở 60°C trong 30 phút, dung dịch được đưa vào phản ứng trong autoclave ở nhiệt độ 100- 170°C và thời gian 6-12h. Sau đó làm nguội autoclave và lây sản pham sau phản ứng ra. Ly tâm sản phâm sau phan ứng
lay kết tủa, rửa sạch kết tủa với ethanol, nước cất và say khô trong không khí ở 80°C thu được sản phẩm cuối cùng.
2.1.4. Các chế độ khảo sát
Các điều kiện tổng hợp luôn ảnh hưởng lớn đến quá trình phản ứng và sản phẩm. Vi vậy, các điều kiện tong hop sé duoc khao sat dé tìm ra điều kiện tối ưu thông qua kết quả đo XRD, SEM của sản phẩm.
Điều kiện cần khảo sát:
1/ Khảo sat ảnh hưởng cua pH (8-10) 2/ Khảo sát thời gian phản ứng (6h-12h) 3/ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng (100°C-170°C)
2.1.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Hình thái và kích thước nano ZnO có thé thay đổi theo pH. Nên cần khảo sát để tìm ra pH thích hợp. pH thích hợp cho dung môi nước được khảo sát theo điều kiện tong hợp theo bảng 2.1.
Bang 2.1: Điều kiện khảo sát ảnh hưởng pH
Zn Dung môi Nhiệt độ phản | Thời gian | Ph (CH3COO)2.2H20 ung phan ứng
8 1,0975¢ 50 mlnước | 100°C 6h 9
10
Nano ZnO được kiểm tra hình thái và kích thước bằng phương pháp SEM.
Dựa trên hình SEM tính toán phan bố kích thước hạt. Từ đó chọn ra pH thích hợp (pH*) ứng với điều kiện pH cho hạt có kích thước nhỏ nhất.
2.1.4.2. Khảo sát thời gian phản ứng
Hình thái và kích thước nano ZnO có thé thay đổi theo thời gian phản ứng.
Nên cần khảo sát để tìm ra thời gian phản ứng thích hợp. Thời gian phản ứng thích hợp được khảo sát theo điều kiện tổng hợp theo bảng 2.2.
Bảng 2.2: Diéu kiện khảo sát thời gian phản ứng
Zn (CH3COOQO)2.2H20 | Dung Nhiệt độ phản | Thời gian phan | pH
môi ứng ứng
6h 50_ mi
1,0975g 100°C Sh pH*
nước
12h
Sản phẩm thu được đem chụp SEM dé xác định thời gian phản ứng thích hợp (tpu) ứng với điều kiện thời gian phan ứng cho kích thước hạt nhỏ nhất .
2.1.4.3. Khảo sát ảnh hướng của nhiệt độ phản ứng
Hình thái và kích thước sản phẩm có thé được kiểm soát bang cách thay đổi nhiệt độ phản ứng trong quy trình tổng hợp theo bảng 2.3:
Bảng 2.3: Diéu kiện khao sát nhiệt độ dun nóng
Zn (CH3COOQO)2.2H20 | Dung Nhiệt độ phản | Thời gian phan | pH
môi ứng ứng
50 ml 100°C nước 120°C
140°C
170°C
San pham thu được đem chụp SEM để tìm ra nhiệt độ phản ứng thích hợp (Tpu) ứng với điều kiện nhiệt độ cho kích thước hạt nhỏ nhất.
2.2. Phương pháp nuôi cấy và lưu trữ nam Phytophtora capsici
2.2.1. Vật liệu- hóa chất
e Vat liệu:
- Chung nắm Phytophtora capsici phan lập trên cây tiêu năm 2015 lấy từ trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khâu 2.
-Đĩa petri, ống nghiệm, erlen 500ml, ống đong 25ml - Que cay, đèn cồn
- Micro pIpet
e Hóa chất - Nước cất, agar
- Khoai tây - D-Glucozo
2.2.2. Chuẩn bị môi trường PDA nuôi cấy
Cân 200g khoai tây đã gọt vỏ và thái nhỏ theo hình hạt lựu kích thước
khoảng 5x5mm. Dun 200g khoai tây này với 1 lít nước cất ở 30 phút. Lưu ý không để cho nước sôi băng cách mở nắp nồi. Dịch chiết thu được sau khi đun trong 30 phút được dùng để hòa tan agar và D- glycozo theo tỉ lệ ( 20g agar + 20g D- glucozo + Ilít dịch chiết từ khoai tây). Môi trường PDA chuẩn bị xong đem đi hap ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,5 atm trong 30 phút
2.2.3. Nuôi cay và lưu trữ nam Phytophtora capsici
e Nuôi cây nam
Nắm bệnh được nuôi cấy trên các đĩa petri chứa môi trường PDA. Cây tơ nắm băng một điểm ở giữa thạch, để ở nhiệt độ phòng cho nắm moc lan tỏa trên đĩa
thạch.
e Lưu trữ nam Chuẩn bị ống thạch nghiêng:
Cho vao trong ống khoảng 7ml môi trường PDA. Dùng nút bông để đậy ống nghiệm và dem di hap tiệt trùng ở ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,5 atm trong 30 phút.
Sau đó, lay ống nghiệm ra và làm ống thạch nghiêng.
Cay nam vào ống thạch nghiêng: Nam bệnh được cấy vào ống thạch nghiêng bang que cay dai. Dé ở nhiệt độ phòng cho nắm mọc lan tỏa trong ống thạch nghiêng.
Sau đó, nắm được lưu trữ trong tủ đông.
2.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng nắm của huyền phù nano ZnO
2.3.1. Nguyên vật liệu
- _ Huyễn phù nano ZnO ( ZnO được phân tán trong nước) với tỷ lệ 32g nano
ZnO/T1lít nước.
- Nam Phytophtora capsici đã được nuôi cây trên đĩa thạch PDA 2 ngày.
- — Môi trường PDA
2.2.2. Thực nghiệm
15ml môi trường PDA 1 ml huyền phù mnọ/40
Vv Vv
Hap tiệt trùng Pha loãng bằng HaO
Vortex
Vv
Đồ dia petri
Vv
Cay nam
Vv
Dé ở nhiệt độ phòng đo đường kính trong 7
Sơ đồ 2.2. Quy trình thử hoạt tính kháng nắm Thí nghiệm được tiễn hành với huyền phù nano ZnO để kiểm tra khả năng ức chế nắm Phytophthora capsici của vật liệu.
Phân tán Iml huyền phù nano ZnO ( đã được thanh trùng ở 70°C) với các nồng độ
2g/1; 4g/I; 4g/I; 16g/l; 32g/I vào 15ml môi trường PDA (nhiệt độ môi trường khoảng
70°C sau khi được tiệt trùng băng nỗi autoclave trong 30 phút ở 121°C). Dùng máy Vortex hỗ trợ phân tán đều huyền phù vào môi trường PDA để được các nồng độ ZnO trong PDA là 125ppm, 250ppm, 500ppm, 1000ppm và 2000ppm. Mẫu đối
chứng được chuẩn bi băng cách thay thế Iml huyền phù bằng Iml nước cất. Tiến hành đồ môi trường trên vào đĩa petri. Mỗi nồng độ thực hiện trên 3 đĩa petri. Cay nắm băng phương pháp đục lỗ (đường kính lỗ 4mm) vào tâm đĩa sau khi thạch đã đông cứng hoàn toàn. Quan sát và đo đường kính tơ nắm từng đĩa petri (đo 4 đường chéo va tính trung bình) sau 1, 2, 3, 4,5,6,7 ngày cấy. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
s% Tinh toán Tính đường kính trung bình theo công thức sau:
DKw = (DKi +DK2+DKs3)/3
Trong đó:
DK: Đường kính trung bình tơ nắm ở đĩa 1 DK>: Đường kính trung bình tơ nắm ở đĩa 2 DK3: Đường kính trung bình tơ nam ở đĩa 3
Với cách đo đường kính trung bình tơ nắm ở mỗi dia petri: Do 4 đường chéo đi qua tâm ( tâm là tâm của điểm cấy ban đâu) và tính trung bình. Nếu với những đĩa mà nắm mọc không tròn hơn thì có thể đo nhiều hơn 4 đường chéo và tính trung
bình.
veyj tifa
Hình 2.1. Cách do đường kinh trung bình tơ nấm trên dia petri
Tính phần trăm ức chế theo công thức:
(DK,—4)—-(DK, —4) x10 DK,, -4
% ức ché= 0
Trong đó:
DKw: Đường kính tơ nam trung bình ở các đĩa đôi chứng DKằ: Đường kớnh tơ nam trung bỡnh ở đĩa thử
Kết quả % ức chế thu được sẽ đánh giá hoạt tính kháng nắm của nano ZnO tổng hợp.